1.4.3.4 Thử nghiệm xác định độ nhạy cảm kháng sinh trong mơi trường lỏng với kính hiển vi đảo ngược (MODS)
MODS đã được mô tả để phát hiện nhanh các MTB kháng thuốc. Nó được dựa trên sự hình thành dây đặc trưng của MTB trong môi trường lỏng khi quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược. Đây được cho là phương pháp xác định nhanh, rẻ tiền, nhạy và đặc hiệu để phát hiện lao kháng thuốc, thích hợp với các nước đang phát triển mà chỉ cần trang bị một kính hiển vi đảo ngược để quan sát sự phát triển của vi khuẩn [5].
1.4.3.5. Thử nghiệm E-test (AB BIODISK)
Thử nghiệm này dựa trên xác định độ nhaỵ cảm thuốc sử dụng các dải có chứa nồng độ kháng sinh bão hào. Tuy nhiên cũng đã có những nghiên cứu cho thấy có tỷ lệ cao đề kháng giả khi thực hiện phương pháp này so với phương pháp sử dụng hệ thống nuôi cấy BACTEC hoặc phương pháp tỷ lệ thông thường trên môi trường LJ [22].
1.4.4 Phƣơng pháp xác định kiểu gen
Đây là những phương pháp cần thiết đẻ xác định nhanh các chủng lao kháng đa thuốc. Không giống như các vi khuẩn khác, sự kháng thuốc của MTB không qua trung gian plasmid. Hầu hết các trường hợp kháng thuốc liên quan đến nhiễm sắc thể đã được làm sáng tỏ. Phân tích di truyền và phân tử của sự đè kháng ở các trường hợp lao kháng đa thuốc cho thấy tính kháng thuốc thường do hoặc vi khuẩn thay đổi đích tác động do đột biến hoặc tạo ra nhiều đích tác động khác. Lao kháng đa thuốc thương là kết quả của sự tích luỹ của các gen đích riêng biệt. Dưới đây là một số phương pháp xác định tính nhạy cảm với thuốc kháng sinh dựa trên nghiên cứu về gen [44,46].
Các phương pháp xác định kiểu gen để xác định tính kháng thuốc của vi khuẩn là tìm kiếm các gen quyết định tính kháng thuốc thay vì tìm kiếm kiểu hình kháng thuốc và bao gồm 2 bước cơ bản: sử dụng kỹ thuật PCR để khuyếch đại các đoạn gen ở genom của các chủng đề kháng; và bước thứ hai là đánh giá sản phẩm khuyếch đại để xác định các đột biến đặc hiệu liên quan đến tính kháng thuốc.
Hiện nay có nhiều phương pháp xác định kiểu gen được ứng dụng để chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc như: PCR-RFLP, PCR-SSCP, DNA microarrays, INNO-LIPA, giải trình tự gen, Western blot, real-time PCR… Các phương pháp này dựa trên cơ sở xác định đột biến ở các gen có liên quan kháng thuốc tương ứng. Phương pháp này sử dụng các kỹ thuật cao đòi hỏi trang thiết bị máy móc hiện đại, tốn kém và cần nhân lực có trình độ chun sâu nhưng thời gian chẩn đoán bằng phương pháp này nhanh hơn nhiều, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, khơng cần nuôi cấy, xác định trực tiếp trên mẫu bệnh phẩm. Rút ngắn thời gian xác định vi khuẩn lao kháng thuốc bằng các phương pháp kinh điển xuống 1-2 ngày, thay vì 4-10 tuần [32,33,42].
1.4.4.1 Phương pháp giải trình tự
Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp của của nucleotid trong phân tử DNA. Hiện nay người ta thường sử dụng hai phương pháp giải trình tự đó là phương pháp dideoxynucleotid và giải trình tự bằng máy tự động.
*Giải trình tự theo phƣơng pháp dideoxynucleotid
Phương pháp này do F. Sanger, Smith và Coulson phát hiện năm 1997. Nguyên lý của phương pháp này: Dideoxynucleotid (ddNTP) là một phân tử nhân tạo, cấu trúc của nó tương tự phân tử deoxynucleotd (dNTP), tuy nhiên ở carbon số 3 của đường deoxyribose khơng phải là nhóm hydroxyl (-OH) mà là -H.
Trong quá trình tổng hợp mạch đơn bổ sung, một dNTP tự do gắn vào chuỗi đang tổng hợp bằng liên kết phosphodieste giữa 5’ phosphat với nhóm 3’ hydroxyl của nucleotid cuối cùng của chuỗi. Tuy nhiên nếu một ddNTP được gắn vào đầu 3’ của chuỗi đang tổng hợp thì sự tổng hợp DNA sẽ dừng lại do khơng hình thành được liên kết phospodieste với nucleotid tiếp theo.
*Giải trình tự bằng máy tự động
Máy giải trình tự gen tự động hồn tồn được thiết kế trên nguyên tắc sử dụng ddNTP do F. Sanger và cộng sự phát minh. Với các máy thế hệ mới sau này, người ta dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP. Nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện được trong một ống nghiệm và chỉ cần điện di trên một hàng mà không phải trên 4 hàng khác nhau như trước đây, hệ thống điện di thường là điện di mao quản. Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và chuyển về máy tính phân tích. Dựa vào màu huỳnh quang mà máy nhận diện dược là nucleotid nào, từ đó biết được tình tự DNA đích.
Giải trình tự sản phẩm sau PCR đã trở thành phương pháp xác định kiểu gen được sử dụng rộng rãi nhất để phát hiện tính kháng thuốc của MTB, nó thực sự chính xác và tin cậy, và nó đã trở thành tiêu chuẩn vàng để phát hiện các đột biến