A4:66,20C A4 A1 A2 A3 A5 A6 A7 A8 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
Nhiệt độ (0C)
Mẫu mang codon 516 dạng đột biến thuộc gen emb
Mẫu mang codon 516 dạng hoang dại thuộc gen emb
70 A1 + B1 - 69,3 A2 + B2 - 68,1 A3 + B3 - 66,2 A4 + B4 - 63,6 A5 + B5 - 62 A6 + B6 - 60,8 A7 + B7 - 60 A8 + B8 -
Bảng 3.9: Bảng thông số kết quả khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 4
Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của phản ứng 3 được thể hiện trong hình 318 và bảng 3.8. Từ kết quả trong hình 3.21 và bảng 3.7, chúng tôi thấy bản mẫu hoang dại hồn tồn cho kết quả âm tính, cịn bản mẫu đột biến cho kết quả dương tính từ nhiệt độ 60-69,50C. Do vậy, để đồng nhất nhiệt độ lai của lơ thí nghiệm cho thuận tiện khi chạy phản ứng trên máy luân nhiệt, chúng tôi cũng chọn nhiệt độ lai là 650C’
3.4 Khảo sát nồng độ mồi của phản ứng
Đối với phản ứng real-time PCR, mồi là yếu tố quyết định tính đặc hiệu của phản ứng. Cặp mồi được thiết kế phải đặc trưng cho đoạn DNA cần khuếch đại, khơng trùng với các trình tự lặp lại trên gen. Việc thiết kế mồi đặc hiệu và sử dụng nồng độ mồi thích hợp sẽ ảnh hưởng đến việc có cho sản phẩm khuếch đại hay khơng. Nếu nồng độ mồi q cao có thể cho kết quả khuếch đại khơng đặc hiệu và tạo ra cấu trúc nhị phân mồi. Nồng độ mồi quá thấp cũng ảnh hưởng đến việc phân tích kết quả của phản ứng. Nồng độ mồi thấp trừ khi mồi có độ suy biến cao.
Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ mồi tối ưu của cặp mồi pha trộn trong phản ứng 1, 2, 3,4 với nồng độ mồi thay đổi theo dãy nồng độ sau: 100; 200; 300; 400; 500nM trong một thể tích phản ứng. Trong thí nghiệm khảo sát nồng độ mồi, chỉ có nồng độ mồi là thay đổi, nhiệt độ lai tối ưu là 650C, còn các thành phần phản ứng cũng không đổi và thêm nước cất cho đủ 25μl.
3.4.1 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 1
Hình 3.19: Kết quả khảo sát nồng độ mồi của phản ứng phát hiện đột biến kháng Isoniazid ở gen katG
Từ kết quả trong hình 3.19 , cho thấy mẫu chứng dương đều cho kết quả dương tính ở tất cả các nồng độ mồi khảo sát; còn mẫu chứng âm đều cho kết quả âm tính (khơng vượt tín hiệu nền), duy chỉ có ở nồng độ mỗi mồi là 500nM cho kết quả dương tính. Ngun nhân có thể là do nồng độ mồi quá cao dẫn đến bắt cặp không đặc hiệu và gây hiện tượng dương tính giả, nên nồng độ mồi tối ưu sẽ nằm trong khoảng 100-400nM. Sau đó, chúng tôi tiến hành lặp lại phản ứng nhiều lần và kết quả khảo sát luôn ổn định, trong đó tại nồng mỗi mồi là 300nM cho kết quả dương tính với tín hiệu mạnh, đường cong của đồ thị là cao nhất, nên chúng tôi chọn nồng độ 300nM là nồng độ mồi tối ưu của phản ứng 1 làm tiêu chí cho các lần khảo sát tiếp theo.
3.4.2 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 2
Hình 3.20 : Kết quả khảo sát nồng độ mồi phản ứng xác định đột biến kháng
300nM 400nM 500nM 200nM 100nM 500nM 400nM 300nM 200nM 100nM 300nM 500nM 400nM 200nM 100nM 500nM 400nM 300nM 200nM 100nM
Căn cứ vào kết quả trong hình 3.20, mẫu MTB mang đột biến vị trí 516 tại gen
rpoB cho kết quả dương tính với tất cả các nồng độ mồi khảo sát, còn mẫu chứng
âm khơng chứa đột biến tại vị trí đều cho kết quả âm tính. Chúng tơi khảo sát lặp lại nhiều lần và kết luận tại nồng độ mỗi mồi là 300nM cho kết quả dương tính mạnh với đường cong đồ thị vượt tín hiệu nền và cao nhất. Từ đó, chúng tơi chọn nồng độ mỗi mồi là 300nM làm nồng độ tối ưu cho các lần khảo sát tiếp theo.
3.4.3 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 3
Hình 3.21: Kết quả khảo sát nồng độ mồi phản ứng xác định đột biến kháng ethambutol tại gen emb(ATG-GTG)
Dựa vào hình 3.1 , mẫu mang đột biến kháng ethambutol cho kết quả dương tính với tất cả các nồng độ mồi khảo sát, cịn mẫu chứng âm khơng chứa đột biến kháng ethambutol đều cho kết quả âm tính. Chúng tơi khảo sát lặp lại nhiều lần và kết luận tại nồng độ mỗi mồi là 300nM cho kết quả dương tính mạnh với đường cong đồ thị vượt tín hiệu nền và cao nhất. Từ đó, chúng tơi chọn nồng độ mỗi mồi là 300nM làm nồng độ tối ưu cho các lần khảo sát tiếp theo.
3.4.4 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 4
Hình 3.22: Kết quả khảo sát nồng độ mồi phản ứng xác định đột biến kháng
300nM 400nM 500nM 200nM 100nM 400nM 300nM 500nM 200nM 100nM 300nM 200nM 400nM 500nM 100nM 200nM 300nM 400nM 500nM 100nM
Dựa vào hình 3.22 , mẫu mang đột biến kháng ethambutol cho kết quả dương tính với tất cả các nồng độ mồi khảo sát, cịn mẫu chứng âm khơng chứa đột biến kháng ethambutol đều cho kết quả âm tính. Chúng tơi khảo sát lặp lại nhiều lần và kết luận tại nồng độ mỗi mồi là 300nM cho kết quả dương tính mạnh với đường cong đồ thị vượt tín hiệu nền và cao nhất. Từ đó, chúng tơi chọn nồng độ mỗi mồi là 300nM làm nồng độ tối ưu cho các lần khảo sát tiếp theo.
3.5 Khảo sát nồng độ mẫu dò (mẫu dò)
Cũng như nồng độ mồi, nồng độ mẫu dò cũng ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng. Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ mẫu dò theo dãy nồng độ sau: 100, 200, 300, 400, 500nM trong một thể tích phản ứng. Trong thí nghiệm khảo sát nồng độ mẫu dị chỉ có nồng độ mẫu dị là thay đổi, cịn các thành phần khác của phản ứng là như nhau và các chỉ tiêu nhiệt độ lai tối ưu, nồng độ mồi tối ưu được giữ nguyên.
3.5.1 Khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 1