Cũng như nồng độ mồi, nồng độ mẫu dò cũng ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng. Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ mẫu dò theo dãy nồng độ sau: 100, 200, 300, 400, 500nM trong một thể tích phản ứng. Trong thí nghiệm khảo sát nồng độ mẫu dị chỉ có nồng độ mẫu dò là thay đổi, còn các thành phần khác của phản ứng là như nhau và các chỉ tiêu nhiệt độ lai tối ưu, nồng độ mồi tối ưu được giữ nguyên.
3.5.1 Khảo sát nồng độ mẫu dị phản ứng 1
Hình 3.23 : Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 1
Qua kết quả trong hình 3.25 chúng tơi nhận thấy mẫu chứng dương đều cho kết quả dương tính và mẫu chứng âm đều cho kết quả âm tính ở các nồng độ mẫu dò khảo sát. Sau nhiều lần lặp lại thí nghiệm, chúng tơi chọn nồng độ mẫu dò là 300nM làm nồng độ tối ưu vì tại nồng độ này phản ứng ổn định, đường cong đồ thị rõ nét và cao nhất.
3.5.2 Khảo sát nồng độ mẫu dị phản ứng 2
Hình 3.24 : Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 2
Từ kết quả phân tích trong hình , sau nhiều lần lặp lại thí nghiệm, mẫu chứng dương cho kết quả là những đường cong vượt tín hiệu nền, cịn mẫu chứng âm cho kết quả là các đường cong khơng vượt qua tín hiệu nền. Qua phân tích kết quả, tại nồng mẫu dị 300nM kết quả ln ổn định và cho đường cong đồ thị cao nhất. Do đó, chúng tơi chọn làm nồng độ tối ưu cho các lần khảo sát kế tiếp.
3.5.3 Khảo sát nồng độ mẫu dị phản ứng 3
Hình 3.25: Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 3
Ảnh hưởng của nồng độ mẫu dò trong phản ứng 3 được thể hiện trong hình 3.25. Từ kết quả trong hình 3.27, ở các nồng độ mẫu dị emb 306-12 khác nhau, mẫu chứng âm đều cho kết quả âm tính, cịn mẫu chứng dương đều cho kết quả dương tính. Tại nồng độ mẫu dò 300nM chứng dương cho kết quả dương tính mạnh
300nM
3.5.4 Khảo sát nồng độ mẫu dị phản ứng 4
Hình 3.26 : Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 4
Từ kết quả phân tích trong hình , sau nhiều lần lặp lại thí nghiệm, mẫu chứng dương cho kết quả là những đường cong vượt tín hiệu nền, cịn mẫu chứng âm cho kết quả là các đường cong khơng vượt qua tín hiệu nền. Qua phân tích kết quả, tại nồng mẫu dị 300nM kết quả ln ổn định và cho đường cong đồ thị cao nhất. Do đó, chúng tơi chọn làm nồng độ tối ưu cho các lần khảo sát kế tiếp.
3.6 Khảo sát nồng độ Mg++
Ion Mg2+ cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng tới kết quả phản ứng. Nếu nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0,5mM) sẽ làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động của Taq DNA polymerase bị ức chế. Ngược lại, nếu nồng độ Mg2+ quá cao sẽ không cho sản phẩm khuếch đại hoặc cho sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu. Ở một nồng độ tối ưu, ion này làm tăng khả năng bắt cặp của mồi vào bản mẫu và hoạt động kéo dài của Taq DNA polymerase, tạo sự kết hợp chặt chẽ giữa các dNTP. Trong thí nghiệm khảo sát nồng độ Mg2+ tối ưu cho các phản ứng, chỉ có nồng độ Mg2+ là thay đổi còn các điều kiện phản ứng như nhiệt độ lai tối ưu, nồng độ mồi, mẫu dò tối ưu vẫn được giữ nguyên.
3.6.1 Khảo sát nồng độ Mg++
phản ứng 1
300nM
Dựa vào kết quả trong hình 3.27, tại các nồng độ Mg2+ được khảo sát, mẫu chứng không mang đột biến đều cho kết quả âm tính, cịn mẫu chứng dương mang đột biến kháng isoniazid đều cho kết quả tín hiệu dương tính. Tại nồng độ Mg2+ là 3,0mM, mẫu chứng dương cho tín hiệu mạnh nhất. Sau khi lặp lại thí nghiệm nhiều lần, chứng dương đều cho kết quả ổn định và mạnh nhất tại nồng độ Mg2+ là 3,0mM. Do vậy, chúng tơi chọn nó làm nồng độ tối ưu.
3.6.2 Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 2
Ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ trong phản ứng 2 được thể hiện trong hình 3.28. Căn cứ vào kết quả từ hình 3.29, trong tất cả các nồng độ Mg2+ được khảo sát, mẫu chứng không mang đột biến Rifampin đều cho kết quả âm tính, mẫu chứng dương mang đột biến kháng Rifampin tại gen rpoB vị trí 516 đều cho kết quả
dương tính.
Hình 3.28: Kết quả khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 2
Tại nồng độ Mg2+ là 3,0mM, mẫu chứng dương cho kết quả dương tính mạnh với đường cong đồ thị cao nhất và ổn định qua nhiều lần khảo sát. Do đó, chúng tơi chọn nó làm giá trị nồng độ Mg2+ tối ưu cho phản ứng 2
3.6.3 Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 3
Hình 3.29: Kết quả khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 3
3.0mM
Căn cứ vào kết quả từ hình 3.29, trong tất cả các nồng độ Mg2+ được khảo sát, mẫu chứng không mang đột biến kháng ethambutol đều cho kết quả âm tính, mẫu chứng amplicon mang đột biến kháng ethambutol tại gen emb vị trí 306 (A→G) đều cho kết quả dương tính. Tại nồng độ Mg2+ là 2,5mM, mẫu chứng dương cho kết quả dương tính mạnh với đường cong đồ thị cao nhất và ổn định qua nhiều lần khảo sát. Do đó, chúng tơi chọn 2,5mM làm giá trị nồng độ Mg2+ tối ưu cho phản ứng 3.