phương pháp tỷ lệ[5]
Phương pháp tỷ lệ là phương pháp lựa chon hiện tại cho việc ước tính kháng thuốc và nguyên tắc này được áp dụng cho ácc phương pháp kiểm tra test nhanh sau đây: BACTEC 460 (thuốc chống lao dòng 1 và 2), MGIT 960, MB/BacT system và ESP II system [13,16].
1.4.1.1.2 Phương pháp tỷ lệ nồng độ ức chế tối thiểu (Resistance ratio method)
Hai hệ thống môi trường nuôi cấy được chuẩn bị với hàm lượng kháng sinh được pha loãng giảm dần bậc hai. Hệ thống thứ nhất dùng để nuôi cấy chủng vi khuẩn lao cần kiểm tra. Hệ thống thứ hai nuôi cấy chủng M. tuberculosis H37Rv
đề kháng được thể hiện ở tỷ lệ MIC của chủng kiểm tra so với MIC của chủng chuẩn. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc được xác định là nồng độ kháng sinh pha lỗng cao nhất trong mơi trường mà số khuẩn lạc vi khuẩn lao phát triển thấp hơn 20. Nếu tỷ số giữa MIC của chủng được kiểm tra với MIC của chủng chuẩn H37Rv nhỏ hơn 2 thì kết luận chủng cần xác định là nhạy cảm với thuốc, còn nếu lớn hơn hoặc bằng 8 thì kết luận là chủng kháng lại thuốc kháng sinh [5,16,26].
Thử nghiệm này cũng bị ảnh hưởng nhiều bởi nồng độ cấy truyền cũng như sự sống sót của các chủng. Hơn nữa những khác biệt trong tính nhạy cảm của chủng chuẩn cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ đề kháng (RR) của các chủng kiểm tra.
1.4.1.2 Phương pháp nồng độ tới hạn
Cũng sử dụng hai hệ thống nuôi cấy, hệ thống 1 là dãy ống nghiệm chứa mơi trường ni cấy có chứa thuốc kháng sinh được pha loãng giảm dần bậc hai và hệ thống 2 là mơi trường kiểm chứng khơng có thuốc kháng sinh. Tính kháng thuốc của chủng được thể hiện là nồng độ thuốc pha loãng cao nhất có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Nồng độ tới hạn trong môi trường được xác định giống như trong phương pháp tỷ lệ nhưng nồng độ được cho là tới hạn lại được xác định tùy theo mỗi phịng thí nghiệm nghiên cứu [12]. Đọc kết quả sau 4 tuần/37oC hoặc 5-6 tuần nếu chưa đạt đủ mức độ sinh trưởng. Nếu trên môi trường chứa thuốc kháng sinh có ít hơn 20 khuẩn lạc so với trên mơi trường đối chứng thì được xác định là nhạy cảm với thuốc kháng sinh. Phương pháp này cũng bị ảnh hưởng nhiều bởi sự sống sót của vi khuẩn [26].
1.4.2. Các phƣơng pháp nuôi cấy cải tiến
Phương pháp nuôi cấy truyền thống trên môi trường thạch tốn thời gian do tốc độ sinh trưởng chậm của các chủng vi khuẩn. Vì vậy một số hệ thống nuôi cấy cải tiến đã ra đời nhằm khác phục nhược điểm này, có thể rút ngắn thời gian chẩn đốn xuống còn 1-2 tuần.
1.4.2.1 Phương pháp sử dụng hệ thống nuôi cấy BACTEC
Sử dụng môi trường lỏng Middlebrook 7H9 biến đổi với nguồn cacbon duy nhất là axit palmitic được đánh dấu phóng xạ 14C. Trong mơi trường chứa thuốc
phóng CO2 chứa 14C. Sự gia tăng CO2 chứa phóng xạ 14C trong mơi trường được tự động phát hiện bằng máy BACTEC 460.
Để thực hiện phương pháp này, sử dụng một lọ mơi trường có chứa chất kháng sinh cần nghiên cứu và lọ kia là mơi trường kiểm chứng khơng có thc kháng sinh rồi dược ủ ở 370C. Nếu sử dụng 2 ống chứng được nuôi cấy với huyền dịch vi khuẩn có độ pha loãng cách nhau 100 lần, thì kết quả được xác định giống như phương pháp tỷ lệ với tỷ lệ sinh trưởng là 1%.
Phương pháp này đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược Phẩm (FDA) của Hoa Kỳ (Mỹ) phê duyệt và cũng được coi là tiêu chuẩn vàng để xác định sự nhạy cảm với các thuốc chống lao dòng 1 [40].
Phương pháp có thể này rút ngắn thời gian chẩn đốn xuống cịn 2-4 tuần. Tuy nhiên do chi phí cao trong đầu tư thiết bị và khó khăn trong xử lý chất thải phóng xạ nên việc áp dụng phương pháp này trong chẩn đốn lâm sàng cịn hạn chế.
1.4.2.2 Phương pháp sử dụng hệ thống nuôi cấy MGIT
Phát hiện sự có mặt của vi khuẩn lao dựa trên việc phát hiện tín hiệu huỳnh quang khi vi khuẩn sinh trưởng trên môi trưởng lỏng Middlebrook 7H9. Gắn phức hợp huỳnh quang (muối ruthenium) ở đáy ống môi trường. Phức hợp này nhạy cảm với sự có mặt của O2
hịa tan trong môi trường, O2 trong môi trường có tác dụng làm mất tín hiệu hiệu huỳnh quang của muối ruthenium.. Lúc đầu do lượng O2
hòa tan trong mơi trường lớn nên kìm chế sự phát quang của phức hợp. Khi có mặt của vi khuẩn trong môi trường, do hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn đã tiêu thụ bớt lượng O2
dẫn đến việc phát sáng của huỳnh quang. Sự phát triển của vi khuẩn cũng có thể được phát hiện bởi sự xuât hiện độ đục không đồng nhất hoặc những hạt nhỏ hay mảnh vụn trong môi trường nuôi cấy.
Để thực hiện phương pháp này, sử dụng một ống nghiệm có chứa kháng sinh và một ống đối chứng, được nuôi cấy với huyền dịch vi khuẩn và ủ ở 370C (ngày 0). Bắt đầu từ ngày thứ ba (ngày 2), các ống được kiểm sốt hàng ngày với một bóng đèn tia cực tím. Sự hiện diện của một chất huỳnh quang màu da cam trong ống chứa kháng sinh tại cùng thời điểm như trong ống chứng hoặc trong vòng hai ngày kể từ
ngày kiểm soát được xác định là sự đề kháng với thuốc, nếu không, được coi là nhạy cảm. Thời gian đọc kết quả tối đa là 14 ngày sau nuôi cấy [13].
Hệ thống nuôi cấy MGIT đã được phê chuẩn để xác định nhanh chóng sự đề kháng của vi khuẩn với thuốc chống lao dòng 1, với kết quả tương dương như các phương pháp truyền thống trên môi trường rắn và hệ thống BACTEC-460.
Hình 1.6. Các ống MGIT cho kết quả dương tính và âm tính
Hệ thống MGIT là một phương pháp thuận tiện, nhanh, tin cậy để thực hiện các thử nghiệm xác định độ nhạy cảm kháng sinh (DST) trực tiếp và gián tiếp ở những nước nghèo, đặc biệt sử dụng khá thành công như một phương pháp phát hiện trực tiếp từ các bệnh phẩm lâm sàng bị nhiễm (đờm) [41]. Tuy nhiên, do chi phí cao trong đầu tư đã hạn chế việc sử dụng rộng rãi hệ thống chẩn đoán này.
1.4.3 Một số phƣơng pháp kiểu hình mới
Những nhược điểm của phương pháp kiểu hình truyền thống mất nhiều thời gian cho việc xác định, cần phải có đội ngũ xét nghiệm có kỹ năng tốt trong hầu hết các kỹ thuật, vì vậy một số phương pháp kiểu hình mới đã ra đời có thể thực hiện trên các chủng đã phân lập hoặc trực tiếp từ bệnh phẩm.
1.4.3.1 Phương pháp sử dụng phage đặc hiệu
Hiện tại có hai dạng của phương pháp sử dụng phage đặc hiệu để phát hiện nhanh sự kháng thuốc của MTB, đó là sự khuếch đại phage một cách sinh học trong
mycobacteriophage phát hiện tín hiệu (Jacobs 1993). Chúng dựa trên khả năng của các chủng MTB còn sống hỗ trợ sự phát triển của mycobacteriophage lây nhiễm. Các phage nội sinh không gây nhiễm bị bất hoạt bởi các hoá chất điều trị. Số lượng phage nội sinh, thể hiện số MTB còn sống ban đầu, được xác định sau chu kỳ gây nhiễm, nhân lên và giải phóng ở mycobacteria phát triển nhanh chóng. Trong trường hợp kháng thuốc, trực khuẩn vẫn cịn sống sót và bảo vệ mycobacteriophage [13].
Thử nghiệm thương mại FastPlaque TB đã được sử dụng để phát hiện sự đề kháng với RIF ở cả chủng MTB phân lập và trực tiếp trên các bệnh phẩm lâm sàng.
*Kỹ thuật sử dụng phage phát hiện tín hiệu luciferase
Chủng vi khuẩn lao được ni cấy trên môi trường chứa thuốc kháng sinh 2-4 ngày sau đó được lây nhiễm bởi mycobacteria phage chứa gen biểu hiện luciferase. Khả năng sống sót của vi khuẩn lao trên môi trường nuôi cấy được phát hiện bằng tín hiệu luciferase trong vịng vài phút sau khi gây nhiễm. Các chủng MTB nhạy cảm với INH hoặc RIF tín hiệu ánh sáng sẽ bị dập tắt, ngược lại với các chủng đề kháng, tín hiệu ánh sáng sẽ tiếp tục được hình thành. Thử nghiệm này với các thuốc chống lao dịng 1 có độ tương đồng 98% so với hệ thống BACTEC TB-460 [5,13].
Tuy nhiên các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, phương pháp phát hiện tính kháng thuốc bằng phage đặc hiệu trên các chủng MTB phân lập được cho phép rút ngắn thời gian chẩn đốn vì khơng phải ni cấy vi khuẩn đến khi hình thành khuẩn lạc có thể quan sát bằng mắt thường, có độ nhạy cao nhưng độ đặc hiệu thấp và thay đổi. Hiện cũng khơng có đủ bằng chứng đánh giá độ chính xác của thử nghiệm này trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc, đặc biệt là trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm đờm [13,40].
1.4.3.2 Phương pháp đo màu
Một số phương pháp đo màu đã được sử dụng trong nững năm gần đây để phát hiện nhanh tính kháng thuốc của M. tuberculosis. Phương pháp này sử dụng tín hiệu
màu chỉ thị cho phản ứng oxy hóa khử để phát hiện sự sinh trưởng của vi khuẩn lao trên mơi trường chứa kháng sinh. Tính kháng thuốc được phát hiện bằng sự thay đổi màu sắc của chất chỉ thị màu tương ứng với số lượng vi khuẩn lao sống sót trong mơi trường. Các chất chỉ thị màu đã được sử dụng cho phương pháp này như alamar blue
hoặc muối tetrazolium 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide. Phương pháp sử dụng chỉ thị màu có độ nhạy tương đối nhưng độ đặc hiệu thấp để phát hiện nhanh MDR-TB [35].
1.4.3.3 Phương pháp khử nitrate
Đây là một kỹ thuật rất đơn giản dựa trên khả năng M. tuberculosis khử nitrate thành nitrite được phát hiện bằng cách thêm một thuốc thử hố học vào mơi trường ni cấy. M. Tuberculosis được nuôi cấy trên môi trường Loewenstein-Jensen chứa chất kháng sinh và khả năng khử nitrate thành nitrite được xác định sau 10 ngày nuôi cấy. Các chủng kháng thuốc sẽ khử nitrate và được nhận ra bởi màu hồng đỏ trong môi trường trong khi các chủng nhạy cảm sẽ mất khả năng này do chúng bị ức chế bởi chất kháng sinh. Một số nghiên cứu gần đây áp dụng phương pháp này trên mẫu bệnh phẩm đờm cho độ nhạy và độ đặc hiệu khác nhau, đặc biệt cho kết quả tốt trong phát hiện đề kháng với INH và RIF [38].
Các phương pháp này đều dựa trên nguyên lý xác định khả năng phát triển của vi khuẩn lao trong mơi trường ni cấy có kháng sinh từ đó đưa ra kết luận về khả năng kháng thuốc của chủng vi khuẩn lao đang nghiên cứu. Nhược điểm của phương pháp này là thời gian nuôi cấy để chẩn đốn dài, ít nhất mất 2 - 4 tuần mới cho kết quả vì thế khơng đáp ứng được cơng tác điều trị và kiểm soát lao kháng thuốc.
1.4.3.4 Thử nghiệm xác định độ nhạy cảm kháng sinh trong mơi trường lỏng với kính hiển vi đảo ngược (MODS)
MODS đã được mô tả để phát hiện nhanh các MTB kháng thuốc. Nó được dựa trên sự hình thành dây đặc trưng của MTB trong môi trường lỏng khi quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược. Đây được cho là phương pháp xác định nhanh, rẻ tiền, nhạy và đặc hiệu để phát hiện lao kháng thuốc, thích hợp với các nước đang phát triển mà chỉ cần trang bị một kính hiển vi đảo ngược để quan sát sự phát triển của vi khuẩn [5].
1.4.3.5. Thử nghiệm E-test (AB BIODISK)
Thử nghiệm này dựa trên xác định độ nhaỵ cảm thuốc sử dụng các dải có chứa nồng độ kháng sinh bão hào. Tuy nhiên cũng đã có những nghiên cứu cho thấy có tỷ lệ cao đề kháng giả khi thực hiện phương pháp này so với phương pháp sử dụng hệ thống nuôi cấy BACTEC hoặc phương pháp tỷ lệ thông thường trên môi trường LJ [22].
1.4.4 Phƣơng pháp xác định kiểu gen
Đây là những phương pháp cần thiết đẻ xác định nhanh các chủng lao kháng đa thuốc. Không giống như các vi khuẩn khác, sự kháng thuốc của MTB không qua trung gian plasmid. Hầu hết các trường hợp kháng thuốc liên quan đến nhiễm sắc thể đã được làm sáng tỏ. Phân tích di truyền và phân tử của sự đè kháng ở các trường hợp lao kháng đa thuốc cho thấy tính kháng thuốc thường do hoặc vi khuẩn thay đổi đích tác động do đột biến hoặc tạo ra nhiều đích tác động khác. Lao kháng đa thuốc thương là kết quả của sự tích luỹ của các gen đích riêng biệt. Dưới đây là một số phương pháp xác định tính nhạy cảm với thuốc kháng sinh dựa trên nghiên cứu về gen [44,46].
Các phương pháp xác định kiểu gen để xác định tính kháng thuốc của vi khuẩn là tìm kiếm các gen quyết định tính kháng thuốc thay vì tìm kiếm kiểu hình kháng thuốc và bao gồm 2 bước cơ bản: sử dụng kỹ thuật PCR để khuyếch đại các đoạn gen ở genom của các chủng đề kháng; và bước thứ hai là đánh giá sản phẩm khuyếch đại để xác định các đột biến đặc hiệu liên quan đến tính kháng thuốc.
Hiện nay có nhiều phương pháp xác định kiểu gen được ứng dụng để chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc như: PCR-RFLP, PCR-SSCP, DNA microarrays, INNO-LIPA, giải trình tự gen, Western blot, real-time PCR… Các phương pháp này dựa trên cơ sở xác định đột biến ở các gen có liên quan kháng thuốc tương ứng. Phương pháp này sử dụng các kỹ thuật cao đòi hỏi trang thiết bị máy móc hiện đại, tốn kém và cần nhân lực có trình độ chun sâu nhưng thời gian chẩn đốn bằng phương pháp này nhanh hơn nhiều, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, khơng cần nuôi cấy, xác định trực tiếp trên mẫu bệnh phẩm. Rút ngắn thời gian xác định vi khuẩn lao kháng thuốc bằng các phương pháp kinh điển xuống 1-2 ngày, thay vì 4-10 tuần [32,33,42].
1.4.4.1 Phương pháp giải trình tự
Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp của của nucleotid trong phân tử DNA. Hiện nay người ta thường sử dụng hai phương pháp giải trình tự đó là phương pháp dideoxynucleotid và giải trình tự bằng máy tự động.
*Giải trình tự theo phƣơng pháp dideoxynucleotid
Phương pháp này do F. Sanger, Smith và Coulson phát hiện năm 1997. Nguyên lý của phương pháp này: Dideoxynucleotid (ddNTP) là một phân tử nhân tạo, cấu trúc của nó tương tự phân tử deoxynucleotd (dNTP), tuy nhiên ở carbon số 3 của đường deoxyribose khơng phải là nhóm hydroxyl (-OH) mà là -H.
Trong quá trình tổng hợp mạch đơn bổ sung, một dNTP tự do gắn vào chuỗi đang tổng hợp bằng liên kết phosphodieste giữa 5’ phosphat với nhóm 3’ hydroxyl của nucleotid cuối cùng của chuỗi. Tuy nhiên nếu một ddNTP được gắn vào đầu 3’ của chuỗi đang tổng hợp thì sự tổng hợp DNA sẽ dừng lại do khơng hình thành được liên kết phospodieste với nucleotid tiếp theo.
*Giải trình tự bằng máy tự động
Máy giải trình tự gen tự động hoàn toàn được thiết kế trên nguyên tắc sử dụng ddNTP do F. Sanger và cộng sự phát minh. Với các máy thế hệ mới sau này, người ta dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP. Nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện được trong một ống nghiệm và chỉ cần điện di trên một hàng mà không phải trên 4 hàng khác nhau như trước đây, hệ thống điện di thường là điện di mao quản. Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và chuyển về máy tính phân tích. Dựa vào màu huỳnh quang mà máy nhận diện dược là nucleotid nào, từ đó biết được tình tự DNA đích.
Giải trình tự sản phẩm sau PCR đã trở thành phương pháp xác định kiểu gen được sử dụng rộng rãi nhất để phát hiện tính kháng thuốc của MTB, nó thực sự chính xác và tin cậy, và nó đã trở thành tiêu chuẩn vàng để phát hiện các đột biến
đột biến đặc trưng trên gen rpoB ở các chủng kháng RIF và để phát hiện các đột