Bảng 3.7 : Bảng thông số khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 2
Vì mục đích thiết kế các phản ứng cùng chạy trên một nhiệt độ như nhau, chúng tôi chọn nhiệt độ 650 C để làm nhiệt độ lai cho phản ứng 2 và tại nhiệt độ này sau nhiều lần khảo sát chứng dương đều cho kết quả dương tính với tín hiệu mạnh, rõ đẹp.
3.3.3 Kháo sát nhiệt độ lai phản ứng 3
Hình 3.17: Bảng thơng số khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 3
Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của phản ứng 3 được thể hiện trong hình 3.17 và bảng 3.8. Từ kết quả trong hình 3.17 và bảng 3.8, chúng tôi thấy bản mẫu hoang dại
Nhiệt độ (0C)
Mẫu mang codon 516 dạng đột biến thuộc gen rpoB
Mẫu mang codon 516 dạng hoang dại thuộc gen rpoB
70 A1 + B1 - 69,3 A2 + B2 - 68,1 A3 + B3 - 66,2 A4 + B4 - 63,6 A5 + B5 - 62 A6 + B6 - 60,8 A7 - B7 - 60 A8 - B8 + A5 63,60C A5 A1 A2 A3 A5 A6 A7 A8 A5 A1 A2 A3 A4 A6 A7 A8 A5: 63,600C
hồn tồn cho kết quả âm tính, cịn bản mẫu đột biến cho kết quả dương tính từ nhiệt độ 60,8-69,50C. Do vậy, để đồng nhất nhiệt độ lai của lơ thí nghiệm cho thuận tiện khi chạy phản ứng trên máy luân nhiệt, chúng tôi cũng chọn nhiệt độ lai là 650C.
Nhiệt độ (0C)
Mẫu mang codon 516 dạng
đột biến thuộc gen emb Mẫu mang codon 516 dạng hoang dại thuộc gen emb
70 A1 + B1 - 69,3 A2 + B2 - 68,1 A3 + B3 - 66,2 A4 + B4 - 63,6 A5 + B5 - 62 A6 + B6 - 60,8 A7 + B7 - 60 A8 - B8 -
Bảng 3.8: Kết quả thông số khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 3
3.3.4 Khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 4
Hình 3.18: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 4
A4:66,20C A4 A1 A2 A3 A5 A6 A7 A8 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
Nhiệt độ (0C)
Mẫu mang codon 516 dạng đột biến thuộc gen emb
Mẫu mang codon 516 dạng hoang dại thuộc gen emb
70 A1 + B1 - 69,3 A2 + B2 - 68,1 A3 + B3 - 66,2 A4 + B4 - 63,6 A5 + B5 - 62 A6 + B6 - 60,8 A7 + B7 - 60 A8 + B8 -
Bảng 3.9: Bảng thông số kết quả khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 4
Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của phản ứng 3 được thể hiện trong hình 318 và bảng 3.8. Từ kết quả trong hình 3.21 và bảng 3.7, chúng tôi thấy bản mẫu hoang dại hồn tồn cho kết quả âm tính, cịn bản mẫu đột biến cho kết quả dương tính từ nhiệt độ 60-69,50C. Do vậy, để đồng nhất nhiệt độ lai của lơ thí nghiệm cho thuận tiện khi chạy phản ứng trên máy luân nhiệt, chúng tôi cũng chọn nhiệt độ lai là 650C’
3.4 Khảo sát nồng độ mồi của phản ứng
Đối với phản ứng real-time PCR, mồi là yếu tố quyết định tính đặc hiệu của phản ứng. Cặp mồi được thiết kế phải đặc trưng cho đoạn DNA cần khuếch đại, khơng trùng với các trình tự lặp lại trên gen. Việc thiết kế mồi đặc hiệu và sử dụng nồng độ mồi thích hợp sẽ ảnh hưởng đến việc có cho sản phẩm khuếch đại hay không. Nếu nồng độ mồi quá cao có thể cho kết quả khuếch đại khơng đặc hiệu và tạo ra cấu trúc nhị phân mồi. Nồng độ mồi quá thấp cũng ảnh hưởng đến việc phân tích kết quả của phản ứng. Nồng độ mồi thấp trừ khi mồi có độ suy biến cao.
Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ mồi tối ưu của cặp mồi pha trộn trong phản ứng 1, 2, 3,4 với nồng độ mồi thay đổi theo dãy nồng độ sau: 100; 200; 300; 400; 500nM trong một thể tích phản ứng. Trong thí nghiệm khảo sát nồng độ mồi, chỉ có nồng độ mồi là thay đổi, nhiệt độ lai tối ưu là 650C, còn các thành phần phản ứng cũng không đổi và thêm nước cất cho đủ 25μl.
3.4.1 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 1
Hình 3.19: Kết quả khảo sát nồng độ mồi của phản ứng phát hiện đột biến kháng Isoniazid ở gen katG
Từ kết quả trong hình 3.19 , cho thấy mẫu chứng dương đều cho kết quả dương tính ở tất cả các nồng độ mồi khảo sát; còn mẫu chứng âm đều cho kết quả âm tính (khơng vượt tín hiệu nền), duy chỉ có ở nồng độ mỗi mồi là 500nM cho kết quả dương tính. Ngun nhân có thể là do nồng độ mồi quá cao dẫn đến bắt cặp không đặc hiệu và gây hiện tượng dương tính giả, nên nồng độ mồi tối ưu sẽ nằm trong khoảng 100-400nM. Sau đó, chúng tơi tiến hành lặp lại phản ứng nhiều lần và kết quả khảo sát luôn ổn định, trong đó tại nồng mỗi mồi là 300nM cho kết quả dương tính với tín hiệu mạnh, đường cong của đồ thị là cao nhất, nên chúng tôi chọn nồng độ 300nM là nồng độ mồi tối ưu của phản ứng 1 làm tiêu chí cho các lần khảo sát tiếp theo.
3.4.2 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 2
Hình 3.20 : Kết quả khảo sát nồng độ mồi phản ứng xác định đột biến kháng
300nM 400nM 500nM 200nM 100nM 500nM 400nM 300nM 200nM 100nM 300nM 500nM 400nM 200nM 100nM 500nM 400nM 300nM 200nM 100nM
Căn cứ vào kết quả trong hình 3.20, mẫu MTB mang đột biến vị trí 516 tại gen
rpoB cho kết quả dương tính với tất cả các nồng độ mồi khảo sát, còn mẫu chứng
âm khơng chứa đột biến tại vị trí đều cho kết quả âm tính. Chúng tơi khảo sát lặp lại nhiều lần và kết luận tại nồng độ mỗi mồi là 300nM cho kết quả dương tính mạnh với đường cong đồ thị vượt tín hiệu nền và cao nhất. Từ đó, chúng tơi chọn nồng độ mỗi mồi là 300nM làm nồng độ tối ưu cho các lần khảo sát tiếp theo.
3.4.3 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 3
Hình 3.21: Kết quả khảo sát nồng độ mồi phản ứng xác định đột biến kháng ethambutol tại gen emb(ATG-GTG)
Dựa vào hình 3.1 , mẫu mang đột biến kháng ethambutol cho kết quả dương tính với tất cả các nồng độ mồi khảo sát, cịn mẫu chứng âm khơng chứa đột biến kháng ethambutol đều cho kết quả âm tính. Chúng tơi khảo sát lặp lại nhiều lần và kết luận tại nồng độ mỗi mồi là 300nM cho kết quả dương tính mạnh với đường cong đồ thị vượt tín hiệu nền và cao nhất. Từ đó, chúng tơi chọn nồng độ mỗi mồi là 300nM làm nồng độ tối ưu cho các lần khảo sát tiếp theo.
3.4.4 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 4
Hình 3.22: Kết quả khảo sát nồng độ mồi phản ứng xác định đột biến kháng
300nM 400nM 500nM 200nM 100nM 400nM 300nM 500nM 200nM 100nM 300nM 200nM 400nM 500nM 100nM 200nM 300nM 400nM 500nM 100nM
Dựa vào hình 3.22 , mẫu mang đột biến kháng ethambutol cho kết quả dương tính với tất cả các nồng độ mồi khảo sát, cịn mẫu chứng âm khơng chứa đột biến kháng ethambutol đều cho kết quả âm tính. Chúng tơi khảo sát lặp lại nhiều lần và kết luận tại nồng độ mỗi mồi là 300nM cho kết quả dương tính mạnh với đường cong đồ thị vượt tín hiệu nền và cao nhất. Từ đó, chúng tơi chọn nồng độ mỗi mồi là 300nM làm nồng độ tối ưu cho các lần khảo sát tiếp theo.
3.5 Khảo sát nồng độ mẫu dò (mẫu dò)
Cũng như nồng độ mồi, nồng độ mẫu dò cũng ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng. Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ mẫu dò theo dãy nồng độ sau: 100, 200, 300, 400, 500nM trong một thể tích phản ứng. Trong thí nghiệm khảo sát nồng độ mẫu dị chỉ có nồng độ mẫu dị là thay đổi, cịn các thành phần khác của phản ứng là như nhau và các chỉ tiêu nhiệt độ lai tối ưu, nồng độ mồi tối ưu được giữ nguyên.
3.5.1 Khảo sát nồng độ mẫu dị phản ứng 1
Hình 3.23 : Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 1
Qua kết quả trong hình 3.25 chúng tơi nhận thấy mẫu chứng dương đều cho kết quả dương tính và mẫu chứng âm đều cho kết quả âm tính ở các nồng độ mẫu dò khảo sát. Sau nhiều lần lặp lại thí nghiệm, chúng tơi chọn nồng độ mẫu dò là 300nM làm nồng độ tối ưu vì tại nồng độ này phản ứng ổn định, đường cong đồ thị rõ nét và cao nhất.
3.5.2 Khảo sát nồng độ mẫu dị phản ứng 2
Hình 3.24 : Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 2
Từ kết quả phân tích trong hình , sau nhiều lần lặp lại thí nghiệm, mẫu chứng dương cho kết quả là những đường cong vượt tín hiệu nền, cịn mẫu chứng âm cho kết quả là các đường cong khơng vượt qua tín hiệu nền. Qua phân tích kết quả, tại nồng mẫu dị 300nM kết quả ln ổn định và cho đường cong đồ thị cao nhất. Do đó, chúng tơi chọn làm nồng độ tối ưu cho các lần khảo sát kế tiếp.
3.5.3 Khảo sát nồng độ mẫu dị phản ứng 3
Hình 3.25: Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 3
Ảnh hưởng của nồng độ mẫu dò trong phản ứng 3 được thể hiện trong hình 3.25. Từ kết quả trong hình 3.27, ở các nồng độ mẫu dị emb 306-12 khác nhau, mẫu chứng âm đều cho kết quả âm tính, cịn mẫu chứng dương đều cho kết quả dương tính. Tại nồng độ mẫu dị 300nM chứng dương cho kết quả dương tính mạnh
300nM
3.5.4 Khảo sát nồng độ mẫu dị phản ứng 4
Hình 3.26 : Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 4
Từ kết quả phân tích trong hình , sau nhiều lần lặp lại thí nghiệm, mẫu chứng dương cho kết quả là những đường cong vượt tín hiệu nền, cịn mẫu chứng âm cho kết quả là các đường cong khơng vượt qua tín hiệu nền. Qua phân tích kết quả, tại nồng mẫu dị 300nM kết quả ln ổn định và cho đường cong đồ thị cao nhất. Do đó, chúng tơi chọn làm nồng độ tối ưu cho các lần khảo sát kế tiếp.
3.6 Khảo sát nồng độ Mg++
Ion Mg2+ cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng tới kết quả phản ứng. Nếu nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0,5mM) sẽ làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động của Taq DNA polymerase bị ức chế. Ngược lại, nếu nồng độ Mg2+ quá cao sẽ không cho sản phẩm khuếch đại hoặc cho sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu. Ở một nồng độ tối ưu, ion này làm tăng khả năng bắt cặp của mồi vào bản mẫu và hoạt động kéo dài của Taq DNA polymerase, tạo sự kết hợp chặt chẽ giữa các dNTP. Trong thí nghiệm khảo sát nồng độ Mg2+ tối ưu cho các phản ứng, chỉ có nồng độ Mg2+ là thay đổi còn các điều kiện phản ứng như nhiệt độ lai tối ưu, nồng độ mồi, mẫu dò tối ưu vẫn được giữ nguyên.
3.6.1 Khảo sát nồng độ Mg++
phản ứng 1
300nM
Dựa vào kết quả trong hình 3.27, tại các nồng độ Mg2+ được khảo sát, mẫu chứng không mang đột biến đều cho kết quả âm tính, cịn mẫu chứng dương mang đột biến kháng isoniazid đều cho kết quả tín hiệu dương tính. Tại nồng độ Mg2+ là 3,0mM, mẫu chứng dương cho tín hiệu mạnh nhất. Sau khi lặp lại thí nghiệm nhiều lần, chứng dương đều cho kết quả ổn định và mạnh nhất tại nồng độ Mg2+ là 3,0mM. Do vậy, chúng tơi chọn nó làm nồng độ tối ưu.
3.6.2 Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 2
Ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ trong phản ứng 2 được thể hiện trong hình 3.28. Căn cứ vào kết quả từ hình 3.29, trong tất cả các nồng độ Mg2+ được khảo sát, mẫu chứng không mang đột biến Rifampin đều cho kết quả âm tính, mẫu chứng dương mang đột biến kháng Rifampin tại gen rpoB vị trí 516 đều cho kết quả
dương tính.
Hình 3.28: Kết quả khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 2
Tại nồng độ Mg2+ là 3,0mM, mẫu chứng dương cho kết quả dương tính mạnh với đường cong đồ thị cao nhất và ổn định qua nhiều lần khảo sát. Do đó, chúng tơi chọn nó làm giá trị nồng độ Mg2+ tối ưu cho phản ứng 2
3.6.3 Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 3
Hình 3.29: Kết quả khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 3
3.0mM
Căn cứ vào kết quả từ hình 3.29, trong tất cả các nồng độ Mg2+ được khảo sát, mẫu chứng không mang đột biến kháng ethambutol đều cho kết quả âm tính, mẫu chứng amplicon mang đột biến kháng ethambutol tại gen emb vị trí 306 (A→G) đều cho kết quả dương tính. Tại nồng độ Mg2+ là 2,5mM, mẫu chứng dương cho kết quả dương tính mạnh với đường cong đồ thị cao nhất và ổn định qua nhiều lần khảo sát. Do đó, chúng tơi chọn 2,5mM làm giá trị nồng độ Mg2+ tối ưu cho phản ứng 3.
3.6.4 Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 4
Hình 3.30: Kết quả khảo sát nồng độ Mg++
phản ứng 4
Căn cứ vào kết quả từ hình 3.30, trong tất cả các nồng độ Mg++ được khảo sát, mẫu chứng không mang đột biến kháng ethambutol đều cho kết quả âm tính, mẫu chứng amplicon mang đột biến kháng ethambutol tại gen vịt trí 306 (G→A) đều cho kết quả dương tính. Tại nồng độ Mg2+ là 3.0mM, mẫu chứng dương cho kết quả dương tính mạnh với đường cong đồ thị cao nhất và ổn định qua nhiều lần khảo sát. Do đó, chúng tơi chọn 3.0mM làm giá trị nồng độ Mg2+ tối ưu cho phản ứng 4.
3.7 Khảo sát độ lặp lại của phản ứng
Tính biến động của phản ứng real-time PCR là một yếu tố rất quan trọng, chính điều này có thể làm sai lệch kết quả. Trên cùng một mẫu bệnh phẩm, kết quả thu được có thể khác nhau giữa các lần thí nghiệm, cũng như giữa các phịng thí nghiệm khác nhau. Khả năng gây ra sự khác biệt này có thể là do thao tác của người tiến hành, sự biến động của các thành phần hóa chất trong phản ứng hoặc do sự
MTB DNA… Để đánh giá độ lặp lại của phản ứng real-time PCR, chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp lại trong cùng một lần thí nghiệm (intra-assay) và độ lặp lại giữa các lần thí nghiệm khác nhau (inter-assay). Các phản ứng được thực hiện trên các điều kiện tối ưu đã được khảo sát.
3.7.1 Khảo sát độ lặp lại trong cùng một lần thí nghiệm
Để đánh giá độ lặp lại trong một thí nghiệm, chúng tơi thực hiện phản ứng trên các mẫu dương đột biến tại gen katG vị trí 315, rpoB vị trí 516, emb vị trí 306
(A→G)và emb vị trí 306 (G→A) ở các nồng độ 104 và 103 bản sao/ml. Mỗi nồng độ được lặp lại 3 lần trong cùng một lần thí nghiệm.
3.7.1.1 Khảo sát độ lặp lại trong một lần thí nghiệm đối với phản ứng 1
Hình 3.31: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phản ứng 1
MTB DNA (bản sao/ml)
Ct(Threshold cycle) Trung
bình Độ lệch chuẩn biến thiên Hệ số
Lần 1 Lần 2 Lần 3
104 27,5 28 28,3 27,9 0,4 0,01
103 32,8 32,8 33,5 33,3 0,4 0,001
Bảng 3.10: Bảng chi tiết kết quả khảo sát về độ lặp lại của phản ứng 1
Kết quả từ hình và bảng cho thấy phản ứng 1có tính lặp lại cao, hệ số biến thiên nội phản ứng có giá trị thấp hơn 1%. Như vậy phản ứng rất ổn định với các chỉ
Lần 1
Lần 2
3.7.1.2 Khảo sát độ lặp lại trong một lần thí nghiệm đối với phản ứng 2
Kết quả từ hình 3.32 và bảng 3.11 cho thấy phản ứng 2 có tính lặp lại cao, giá trị biến thiên nội phản ứng có giá trị thấp hơn 1%.
Hình 3.31: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phản ứng 2
MTB DNA (bản sao/ml)
Ct(Threshold cycle) Trung bình Độ lệch chuẩn Hệ số biến thiên Lần 1 Lần 2 Lần 3 104 28,9 29,3 29,5 29,2 0,305 0,01 103 32,8 33 33 32,9 0,11 0,003
Bảng 3.11: Bảng chi tiết kết quả khảo sát về độ lặp lại của phản ứng 2