CHƢƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Các phương pháp xác định đột biến gen ty thể
1.3.2. PCR kết hợp RFLP (PCR-RFLP)
Nỗ lực đầu tiên trong việc phát hiện các biến dị di truyền ở mức độ DNA được thực hiện nhờ kết hợp sử dụng các enzyme giới hạn.
Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzyme giới hạn. Khi ủ DNA với enzyme giới hạn ở dung dịch đệm thích hợp ở pH, nhiệt độ thích hợp sẽ tạo ra những phân đoạn DNA với kích thước khác nhau, từ đó lập nên các bản đồ gen. Kỹ thuật này được sử dụng phổ biến từ thập niên 80 đến nay. Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt giới hạn đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen. Sự khác biệt về trình tự nucleotide của đối tượng này so với đối tượng kia có thể dẫn đến sự thêm hay bớt đi các điểm phân cắt của các enzyme giới hạn, làm cho các đoạn DNA phân cắt có kích thước khác nhau, có thể nhận biết được dựa trên phổ băng điện di.
Như vậy, biến dị xảy ra trong trình tự của DNA tại những vị trí giới hạn đặc hiệu sẽ dẫn đến tính đa hình trong chiều dài của các đoạn DNA giới hạn (RFLP) khi được cắt bởi cùng một loại enzyme giới hạn đặc hiệu. Hiện tượng này đã tạo ra sự đa dạng trong chiều dài của các đoạn DNA mà khi điện di chúng trên gel, chuyển lên trên màng lai và dùng các probe đặc hiệu có hoạt tính phóng xạ để phát hiện thì có thể đánh giá được các biến dị này.
Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn. Kĩ thuât PCR còn gọi là kỹ thuật nhân gen in vitro do Karl Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985. Nguyên tắc: phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả năng tổng hợp DNA in vitro của DNA polymerase để nhân bản in vitro các đoạn
DNA (gen) khác nhau lên hàng triệu lần so với ban đầu. Do DNA polymerase hoạt động theo nguyên tắc cần phức hợp khn-mồi, trong mơi trường thích hợp có các dNTP thì sẽ kéo dài mồi thành sợi bổ sung với sợi khn. Vì vậy để nhân bản được đoạn DNA đích, người ta cần phải biết được trình tự nucleotide ở hai đầu của đoạn DNA cần nhân bản để từ đó thiết kế nên các mồi (primer) đặc hiệu. Kỹ thuật này có hai điểm quan trọng, thứ nhất là đoạn DNA khn sẽ được nhân lên ở trình tự nằm giữa hai mồi (mồi xi và mồi ngược), do đó khơng cần phải tách DNA cần nhân lên ra khỏi đoạn gen mà chỉ cần xác định đúng mồi cho đoạn cần nhân lên để nó gắn được với khn tại điểm khởi đầu sao chép, thứ hai là DNA polymerase được điều khiển để tổng hợp lên đoạn DNA đặc thù nằm giữa hai mồi này, kết quả là đoạn
DNA định trước được nhân lên. Đáng chú ý là kỹ thuật phản ứng PCR rất nhạy, chỉ địi hỏi một lượng khn ban đầu rất nhỏ (khoảng 10-3 g) để phản ứng có thể diễn ra.
Phối hợp PCR-RFLP sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát hiện các biến dị di truyền ở mức DNA hiệu quả hơn rất nhiều so với các phương pháp cổ điển. Một cặp mồi oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát, sau đó đoạn DNA được khuếch đại được cắt bằng các RE, điện di và phân tích trên gel nhuộm ethidium bromide hoặc bạc. PCR-RFLP bỏ qua bước lai nên giá thành rẻ hơn và ít nguy hiểm hơn phương pháp RFLP.
Các đột biến điểm trong mtDNA có thể phát hiện dễ dàng bằng kỹ thuật PCR-RFLP. Bước đầu tiên là thiết kế mồi n hân đoa ̣n mtDNA cần kiểm tra bằng PCR, sản phẩm PCR được cắt bằng enzym e giớ i ha ̣n , sau đó điê ̣n di trên gel polysacrylamide không biến tính. Việc sử dụng enzyme giới hạn có ý nghĩa quyết định
trong việc phát hiện đột biến điểm trong mtDNA. Dựa trên trình tự nhận biết của enzyme có sẵn trên đoạn DNA chứa đột biến điểm hoặc do chủ động thiết kế mồi mà có thể xác định được mẫu bị đột biến và không đột biến sau phản ứng cắt enzyme.
Sử dụng phương pháp PCR-RFLP, một đột biến T14728C trong mtDNA của gen mã hóa cho tRNAGlu trong một bệnh nhân nữ 56 tuổi, có biểu hiện bệnh não cơ ty thể nặng đã được xác định bởi Nogueira và tập thể [28]. Đoạn DNA nhân bản có kích thước 153 bp, khi được cắt bằng DraI (TTT/AAA), thì mẫu DNA bình thường, có trình tự nhận biết của DraI (TTT/AAA) sẽ bị cắt thành hai đoạn 127 bp và 26 bp, mẫu DNA đột biến thì khơng có vị trí cắt của DraI nên sẽ giữ ngun kích thước là 153 bp.
Ngày nay, rất nhiều đột biến điểm trong hệ gen ty thể và hệ gen nhân đã được phát hiện nhanh chóng bằng kỹ thuật PCR-RFLP.