Tách plasmid theo phương pháp của Sambrook và Russell

CHƢƠNG II : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.2. Tách plasmid theo phương pháp của Sambrook và Russell

Sau khi nuôi cấy trên đĩa thạch, một khuẩn lạc trắng (mang plasmid biến nạp mong muốn) được lấy để nuôi trong 5 ml môi trường LB lỏng, nuôi cấy lắc ở 370

C qua đêm. Dung dịch có chứa khuẩn lạc ni cấy được dùng để thu nhận plasmid tinh sạch.

5 ml dung dịch tế bào vi khuẩn trên được đem ly tâm 6.000 vòng/phút trong 10 phút, lớp dịch nổi được loại bỏ và chỉ thu tủa tế bào. Tủa tế bào được hịa trong 100 µl dung dịch I (Tris-HCl 50 mM, EDTA 10 mM , pH 8) đã được làm lạnh và trộn hỗn hợp cho kỹ đến khi tủa tan hồn tồn rồi ủ ở nhiệt độ phịng trong 5 phút. Cho 200 µl dung dịch II bao gồm SDS 10% và NaOH 200 mM vào dung dịch trên, trộn đều hỗn hợp bằng cách đảo ống 4-6 lần và để trên đá trong 5 phút trong thời gian này màng tế bào bị phá vỡ giải phóng plasmid. Tiếp theo, 150 µl dung dịch III (kali acetate 3 M, pH 5,5) lại được thêm vào hỗn hợp và trộn đều bằng cách đảo ống 4-6 lần rồi để trên đá trong 5 phút để trung hịa dung dịch. Sau đó, hỗn hợp được đem ly tâm 14.000 vòng/phút trong 20 phút, thu dịch nổi và loại bỏ tủa (nên tránh hút lẫn tủa). DNA được kết tủa bằng cách thêm 70% thể tích isopropanol vào hỗn

hợp vừa thu được và ly tâm 14.000 vòng/phút trong 20 phút, DNA tủa ở dưới đáy ống sẽ được thu lại. Tủa vừa thu được đem hịa trong 50 µl H2O có bổ sung 1 µl RNase và ủ ở 370C trong 15 phút. Tiếp đó cho vào đó một thể tích tương đương phenol: chloroform: Isoamylalcohol (trộn theo tỷ lệ 25 : 24 : 1 về thể tích), trộn kỹ để protein tủa hồn tồn, tiếp đến ly tâm 14.000 vòng/phút trong 15 phút và thu dịch nổi. Hỗn hợp vừa thu được này sau đó được thêm vào 1/10 thể tích CH3COOK 3 M, pH 5,2 và 2,5 thể tích ethanol 100% và để ở -200

C trong 20 phút cho DNA kết tủa hoàn toàn, rồi ly tâm 14.000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C. Tủa DNA thu được ở bước này được rửa 2 lần bằng ethanol 70%, sau đó được làm khơ tự nhiên trong 10 phút. Cuối cùng DNA được hịa tan vào 50-100 µl H2O, bảo quản ở -200C đến khi dùng.