CHƢƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Các phương pháp xác định đột biến gen ty thể
1.3.4. PCR định lượng
Về nguyên tắc kỹ thuật Real time-PCR cũng dựa trên khả năng nhân bản một trình tự DNA đích khi có mặt cặp mồi đặc hiệu của enzyme DNA polymerase. Tuy nhiên, khác với kỹ thuật PCR thông thường, Real time- PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy các sản phẩm khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra do trong hỗn hợp có bổ sung thêm chất phát tín hiệu. Chất phát tín hiệu này khi liên kết với sản phẩm PCR sẽ phát tín hiệu huỳnh quang và được bộ phận phát hiện huỳnh quang của máy PCR thu nhận. Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh lượng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ. Chính vì vậy, kỹ thuật Real time- PCR có độ chính xác và độ nhạy rất cao, tiết kiệm thời gian. Hơn nữa, kỹ thuật này còn giúp giảm nguy cơ ngoại nhiễm và các thao tác sau phản ứng khuếch đại.
Để định lượng một loại đột biến điểm trong DNA bằng phương pháp Real-
time PCR, đầu tiên sử dụng plasmid tái tổ hợp chứa đoạn chèn có đột biến và khơng đột biến để xác định hàm lượng DNA có trong mẫu tách chiết plasmid bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm để xác định số bản copy có trong mẫu tách chiết, sau đó pha lỗng mẫu lần lượt thành109 copy–10 copy/l dùng làm khuôn cho phản ứng Real-time PCR. Hai loại mẫu dò đánh dấu huỳnh quang được thiết kế có trình tự nucleotide bổ sung với trình tự khn bị đột biến và khơng đột biến. Sau đó tiến hành phản ứng PCR, thiết bị ổn nhiệt chu kỳ (máy PCR) được gắn với một module phát hiện tín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra. Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch đại trong mỗi chu kỳ. Dựa vào đồ thị chuẩn được xây dựng đồng thời trong quá trình chạy real-time, có thể xác định được số bản copy DNA được nhân lên sau n chu kỳ và từ đó chúng ta định lượng số copy khởi đầu của khn mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao, dựa vào cơng thức:
Nf = No (1+Y)n-1
Trong đó Nf: số đoạn DNA cuối cùng, No: số đoạn DNA ban đầu, Y: hiệu quả kéo dài mồi [5]. Bệnh tiểu đường, bệnh điếc và bệnh não cơ ty thể, tăng acid lactic máu với triệu chứng giống như đột quỵ được di truyền từ mẹ sang con là kết quả từ đột biến điểm A3243G ty thể. Một nghiên cứu được thực hiện bởi Singh và tập thể [35] kiểm tra trên 293 mẫu gồm 23 mẫu dương tính, 40 mẫu âm tính và 230 mẫu từ những bệnh nhân được phân loại lâm sàng bị tiểu đường type 2. Tất cả các mẫu dương tính được phát hiện chính xác và tất cả những mẫu đó được định lượng, mức độ đột biến được xác định sử dụng thí nghiệm Realtime với hệ số tương quan tốt (r2 = 0,88 và 0,93). Thiết kế mồi và mẫu dị để nhận dạng trình tự bình thường (A) và trình tự đột biến (G) ở vị trí nucleotide A3243G của genome ty thể. Mẫu dò chỉ khác nhau 1 nucleotide để phân biệt đột biến. Gắn mẫu dị đột biến và khơng đột biến với chất phát huỳnh quang khác nhau cho phép định lượng đột biến A3243G trong mỗi ống phân tích:
Mẫu dị Trình tự Vùng mtDNA
Bình thường VIC-CCGGGCTCTGCCAT-MGB 3237-3250 Đột biến 6FAM-CCGGGCCCTGCCAT-MGB 3237-3250
Mẫu dò gắn đầu 5’ với 6-FAM hay VIC và đầu 3’ là MGB (minor groove binding protein). Sử dụng MGB làm tăng nhiệt độ nóng chảy của hai phần mẫu dị/khn và cho phép sử dụng mẫu dị ngắn hơn, đặc trưng hơn. Ngồi ra, người ta có thể sử dung mồi chứa nucleotide cải tiến (locked nucleic acid) để tạo ra sự khác nhau rõ rệt về nhiệt độ gắn của mẫu dị đối với dạng bình thường và đột biến chỉ khác nhau một nucleotide.
Phương pháp này có giá trị bởi thí nghiệm trộn hỗn hợp (mixing) và phân tích đường chuẩn. Plasmid có đột biến và không đột biến được trộn lẫn để tạo ra mẫu có nồng độ đột biến A3243G thay đổi 0,01-100%, được sử dụng để xác định mức độ thấp nhất để nhận ra đột biến dựa trên đường chuẩn. Kết quả là mức độ đột biến ở các mẫu bệnh nhân nằm trong phạm vi từ 3 tới 60%. Riêng có một mẫu dương tính (bệnh nhân nam 77 tuổi) từ 230 mẫu bệnh nhân được phân loại lâm sàng bị tiểu đường type 2 cho thấy 0,6% heteroplasmy (đột biến A3243G), mà trước đây này bằng phương pháp PCR-RFLP không phát hiện được đột biến ở bệnh nhân này. Chứng tỏ phương pháp này có độ nhạy rất cao [35].
Để theo dõi sự suy yếu mtDNA, một phương pháp định lượng chính xác số bản copy mtDNA bằng realtime PCR được phát triển bởi Strand và tập thể [37].
Nghiên cứu đã định lượng đột biến A3243G trên gene tRNALeu gây hội chứng MELAS (đột biến này cũng kết hợp với bệnh tiểu đường và mất khả năng nghe di truyền theo mẹ) và đột biến T8993G là đột biến gene ATPase6 trên mtDNA liên quan đến hội chứng NARP (gây bệnh yếu cơ ngoại biên do tổn thương thần kinh, rối loạn cảm giác, thất điều, viêm võng mạc sắc tố) khi tần số đột biến thấp và gây hội chứng Leigh khi xuất hiện với tần số đột biến cao.