Đường chạy 1: Thang chuẩn DNA 1 kb, 2: Mẫu kiểm tra âm, 3-8: DNA của các bệnh nhân khác nhau
Chúng tôi cũng đã tiến hành đo mật độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại của chế phẩm DNA tổng số từ 72 mẫu bệnh nhân để đánh giá độ tinh sạch cũng như xác định hàm lượng DNA. Kết quả thu được (Phụ lục 1) cho thấy các mẫu DNA đều có tỷ số A260/A280 nằm trong khoảng 1,80−2,0, chứng tỏ chế phẩm ít lẫn protein hay RNA. Hàm lượng DNA trung bình khá cao đạt 41,5 ng/µl. Như vậy, chúng tơi đã thu được các sản phẩm DNA tổng số đạt yêu cầu để tiến hành các bước thí nghiệm tiếp theo.
3.2. Phát hiện đột biến A8344G và đột biến mất đoạn 9 bp bằng PCR-RFLP
Vì đoạn gen mang đột biến A8344G liên quan đến hội chứng MERRF nằm gần đoạn lặp 9 bp CCCCCTCTA, nên chúng tơi nghiên cứu sự có mặt của hai đột biến này cùng nhau.
3.2.1. Nhân bản đoạn gen từ 8155-8366 bằng PCR
Chúng tôi đã dùng kỹ thuật PCR với mồi xuôi (8155-8175) bắt cặp hồn tồn với sợi khn và mồi ngược (8366-8345) chứa một điểm không bắt cặp với sợi khn có trình tự dưới đây để nhân bản đoạn gen 212 bp (8155-8366) trong hệ gen ty thể.
Tên mồi Trình tự
MRAG Fw 5’GGT ATA CTA CGG TCA ATG CTC 3’ (nt 8155-8175) MRAG Rv 5’ TTT CAC TGT AAA GAG GTG TGG G3’ (nt 8366-8345)
Đoạn DNA mà chúng tơi nhân bản là trình tự thường có thể mang: i) đột biến mất đoạn 9 bp nằm ở một trong hai trình tự lặp lại CCCCCTCTA từ vị trí 8272- 8289; ii) đột biến điểm A8344G.
Đoạn gen khi khơng có đột biến mất đoạn cũng như đột biến A8344G sẽ có chiều dài 212 bp và khi khơng có đột biến A8344G thì chứa 2 điểm cắt của BanII
(GAGCCC và GGGCCC). Đoạn gen khi được nhân bản bằng PCR và được cắt bằng enzyme BanII sẽ tạo ra 3 đoạn với kích thước là 99 bp, 41 bp và 72 bp. Nếu có đột biến A8344G, với cách thiết kế mồi vừa nêu thì đoạn DNA nhân bản sẽ có thêm một điểm cắt ở đoạn 72 bp (GAGCCC), và khi đó sản phẩm cắt bằng BanII sẽ gồm 4 đoạn với kích thước là 99 bp, 41 bp, 52 bp và 20 bp. Khi có đột biến mất đoạn 9 bp, thì đoạn gen nhân bản chỉ cịn 203 bp và nếu được cắt bằng BanII sẽ cho 4 băng với kích thước là 99 bp, 32 bp, 52 bp và 20 bp. Băng 20 bp khó được nhìn thấy trên gel vì kích thước qúa nhỏ nên có thể chạy ra khỏi gel.
Kết quả điện di agarose 2% sản phẩm PCR (hình 10) cho thấy sự xuất hiện của băng DNA với kích thước như mong đợi (203-212 bp) ở các mẫu có DNA tách
từ bệnh nhân, trong khi đó mẫu kiểm tra âm (khơng chứa DNA) không cho băng DNA nhân bản nào. Như vậy, cặp mồi chúng tôi thiết kế là đặc hiệu cao cho việc nhân bản đoạn DNA có kích thước 212 bp.