Kết quả điện di sản phẩm PCR cắt bằng BanII trên gel polyacrylamide

Đường chạy 1: thang chuẩn DNA Low Range, 2: Sản phẩm PCR không cắt BanII, 3→10: Sản phẩm PCR từ mẫu DNA của các bệnh nhân được cắt bằng enzyme BanII

Tất cả các mẫu nghi ngờ đều khơng cịn băng 41 bp nên đột biến mất đoạn này ở dạng homoplasmy ở tất cả các trường hợp, có nghĩa là đột biến mất đoạn có mặt ở tất cả các bản copy của DNA ty thể.

Để khẳng định tính chất di truyền theo dịng mẹ của các gen trên hệ gen ty thể. Chúng tôi đã kiểm tra phổ băng PCR-RFLP của 4 gia đình (ký hiệu I, II, III và IV) có bệnh nhân nghi ngờ mất đoạn. Kết quả điện di ở hình 13 cho thấy sản phẩm PCR với mẫu DNA khuôn của bố bệnh nhân của cả 4 gia đình sau khi cắt bằng

BanII có 3 băng với kích thước 99 bp, 72 bp và 41 bp giống như mẫu bình thường

(hình 13, đường chạy 5, 10, 15 và 18). Trong khi đó sản phẩm PCR với DNA khuôn của mẹ bệnh nhân ở cả 4 gia đình được cắt bằng BanII đều cho 3 băng DNA có kích thước 99 bp, 72 bp và 32 bp (hình 13, đường chạy 4, 9, 14, 17) giống như mẫu bệnh nhân nghi ngờ đột biến mất đoạn (hình 13, đường chạy 3, 8, 13 và 16). Kết quả này

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 41 72 99 bp p 212

chứng tỏ bố bệnh nhân của cả 4 gia đình đều khơng mang đột biến mất đoạn, còn bệnh nhân và mẹ bệnh nhân của 4 gia đình đều mang đột biến mất đoạn.

Hình 13: Kết quả điện di sản phẩm PCR ở một số gia đình bệnh nhân cắt bằng BanII trên gel polyacrylamide

Đường chạy 1, 6 và 11: Thang chuẩn DNA Low Range; 2, 7 và 12: Sản phẩm PCR với khuôn DNA của bệnh nhân I , II, III và IV không cắt BanII; 3, 8, 13 và 16: Sản phẩm PCR với khn DNA tương ứng của bệnh nhân gia đình I, II, III và IV được cắt bằng BanII; 4, 9, 14 và 17: Sản phẩm PCR với khuôn DNA tương ứng của mẹ bệnh nhân gia đình I, II, III và IV được cắt bằng BanII; 5, 10, 15 và 18: Sản phẩm PCR với khuôn DNA tương ứng của bố bệnh nhân gia đình I, II, III và IV được cắt bằng BanII.

Để có thêm bằng chứng về di truyền từ mẹ sang con của đột biến mất đoạn 9 bp, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra phổ băng PCR đoạn gen 212 bp của hai gia đình bệnh nhân khác, mỗi gia đình có 2 con. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 15% (Hình 14) cho thấy băng DNA nhân bản ở mẫu các con và mẹ bệnh nhân đều chạy nhanh hơn băng DNA nhân bản ở mẫu bố bệnh nhân. Kết quả này một lần nữa bổ sung tính chất di truyền theo dịng mẹ của đột biến mất đoạn 9 bp.

11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 3 4 5 212 99 72 41 bp p 6 7 8 9 10 212 99 72 41 bp p

3.2.3. Phân tích trình tự mất đoạn 9 bp trên gen ty thể

Để khẳng định chắc chắn những kết luận do phương pháp PCR-RFLP thu được trên đây, chúng tôi tiến hành nhân dòng đoạn DNA được nhân bản bằng PCR vào vector pGEM-T và giải trình tự đoạn DNA kích thước 212 bp đối với sáu gia đình (I, II, III, IV, V, VI). Kết quả được minh họa với thành viên gia đình III.

Sản phẩm PCR được gắn với vector pGEM-T và được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Các tế bào được nuôi trên đĩa thạch LB có 50-100 µg/ml

ampicillin, cơ chất X-gal và chất cảm ứng IPTG. Sau khi được nuôi qua đêm ở 37oC, các khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng xuất hiện. Các khuẩn lạc màu trắng theo lý thuyết là chứa vector tái tổ hợp (hình 15).

Hình 15: Kết quả biến nạp hỗn hợp gắn giữa sản phẩm PCR và vector pGEM-T Hình 14: Kết quả điện di sản phẩm PCR hai gia đình bệnh nhân trên gel polyacrylamide

Đường chạy 1: Thang chuẩn DNA Low Range; 2: Đối chứng âm (khơng có khn DNA); 3, 7: Sản phẩm PCR với khn DNA tương ứng của bệnh nhân gia đình V và VI; 4, 8: Sản phẩm PCR với khuôn DNA tương ứng của anh trai bệnh nhân gia đình V và em trai bệnh nhân gia đình VI; 5, 9: Sản phẩm PCR với khuôn DNA tương ứng của mẹ bệnh nhân gia đình V và VI; 6, 10: Sản phẩm PCR với

khuôn DNA tương ứng của bố bệnh nhân gia đình V và VI.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen đích (đoạn 212 bp) trong vector tái tổ hợp ở các khuẩn lạc trắng, chúng tôi chọn một khuẩn lạc xanh và một số khuẩn lạc trắng rồi tiến hành PCR sử dụng hai cặp mồi: i) Cặp mồi pUC19Fw và pUC19Rv có trình tự nằm trên vector pGEM-T với khoảng cách giữa hai mồi là 296 bp; ii) Cặp mồi MRAGF và MRAGR đặc hiệu cho đoạn DNA 212 bp chèn vào vector pGEM-T.

Kết quả điện di (hình 16) cho thấy sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc xanh với cặp mồi pUC19Fw và pUC19Rv cho băng DNA có kích thước khoảng 0,3 kb mà theo tính tốn lý thuyết là 296 bp (hình 16B, đường chạy 7), còn với cặp mồi MRAGF và MRAGR không cho băng DNA nào (hình 16A, đường chạy 2). Sản phẩm PCR với các khuẩn lạc trắng khi sử dụng cặp mồi pUC19Fw và pUC19Rv (hình16B, đường chạy 8, 9, 10) cho băng DNA có kích thước khoảng 0,5 kb mà theo tính tốn lý thuyết là 508 bp, cịn với cặp mồi MRAGF và MRAGR (hình 16A, đường chạy 3, 4, 5) cho băng DNA có kích thước khoảng 212 bp. Như vậy, chúng tôi đã thu được các khuẩn lạc trắng có vector tái tổ hợp mang đoạn DNA mong muốn.

A B

A: PCR với mồi MRAGF và MRAGR, B: PCR với cặp mồi pUC19F và pUC19R Đường chạy 1: Thang chuẩn DNA 100 bp; 6: Thang chuẩn DNA 1 kb; 2, 7: Sản phẩm

PCR từ khuẩn lạc xanh; 3, 4, 5 - 8, 9, 10: Sản phẩm PCR từ khuẩn lạc trắng tương ứng của mẫu bệnh nhân, mẹ và bố bệnh nhân ở gia đình III.

Từ các khuẩn lạc thu được, một số khuẩn lạc trắng được chọn ngẫu nhiên để nuôi trong môi trường LB lỏng, chuẩn bị cho bước tinh sạch plasmid. DNA được tách chiết từ tế bào vi khuẩn thường tồn tại ở 3 dạng: dạng siêu xoắn được tạo

Hình 16: Kết quả điện di sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc

508 296 6 7 8 9 10 bp 212 1 2 3 4 5 bp

thành do liên kết hydro giữa một số phần của phân tử DNA plasmid hay do lực hút tĩnh điện giữa các phần của phân tử với nhau, dạng vòng mở do bị đứt gãy một mạch đơn của chuỗi DNA mạch kép và dạng mạch thẳng khi cả hai mạch DNA đều bị đứt gãy. Dạng siêu xoắn có cấu trúc khơng gian gọn nên khi điện di chúng thường chạy nhanh nhất, tiếp đến là mạch thẳng và cuối cùng là mạch vòng.

Kết quả điện di ở hình 17 cho thấy sự xuất hiện của một số băng có kích thước lớn hơn là do hiện tượng plasmid tồn tại ở các dạng xoắn và siêu xoắn khác nhau vì vậy có độ di động điện di khác nhau như vẫn thường gặp ở các loại plasmid dạng mạch vịng khác. Chế phẩm plasmid thu được có độ tinh sạch cao, khơng lẫn RNA và có kích thước băng đúng như tính tốn lý thuyết (lớn hơn 3 kb). Trong đó băng chạy trước sáng và rõ nét chứng tỏ lượng DNA plasmid thu được tồn tại ở dạng siêu xoắn nhiều hơn dạng thẳng và rất ít dạng đứt gãy. Những plasmid tái tổ hợp này được tách chiết với lượng lớn và đủ độ tinh sạch để tiến hành xác định trình tự.

Chúng tơi đã tiến hành giải trình tự đoạn gen đích trong vector tái tổ hợp thu được ở trên và so sánh trình tự vừa đọc được với trình tự gốc chuẩn rCRS (mã số J01415.2 trong Ngân hàng gen). Kết quả so sánh trình tự đoạn gen (Hình 18) cho thấy đoạn gen từ vector tái tổ hợp pGEM-T của bố bệnh nhân có độ tương đồng 99,53% so với trình tự chuẩn tương ứng của hệ gen ty thể cơng bố trên GenBank [44]. Chỉ có một nucleotide (C) vị trí 193 là khơng khớp với nucleotide (A) ở vị trí 8347 (trên genome ty thể hoàn chỉnh), nguyên nhân của sai khác này là do chúng tôi chủ động thay thế nucleotide T bằng G trong mồi MRAGRv khi thiết kế. Ngoài ra, kết quả cũng cho thấy đoạn gen đích của mẫu bố bệnh nhân chứa đầy đủ 2 trình tự lặp lại 9 bp là CCCCCTCTACCCCCTCTA.

Hình 17: Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch plasmid trên gel agarose

1 2 3 4

Đường chạy 1: Thang

chuẩn DNA 1 kb; 2, 3, 4: plasmid tinh sạch gia đình bệnh nhân III.

Tuy nhiên, trình tự đoạn gen của bệnh nhân và người mẹ chỉ có độ tương đồng 95,3% so với trình tự chuẩn tương ứng của hệ gen ty thể công bố trên GenBank, do mất đi 9 nucleotide CCCCCTCTA so với trình tự chuẩn, ngồi ra có sự sai khác một nucleotide (C thay cho A ở vị trí 184 trong đoạn gen được nhân lên) do cách thiết kế mồi ban đầu của chúng tôi.

Dưới đây là một phần trình tự tự nucleotide và tín hiệu huỳnh quang thu được từ máy CEQ8000 khi xác định trình tự mẫu gia đình bệnh nhân III.

A. Bố Bệnh nhân

Hình 18: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen bệnh nhân, mẹ bệnh nhân và bố bệnh nhân gia đình III với trình tự chuẩn hệ gen ty thể công bố trên GenBank

B. Mẹ Bệnh nhân

C. Bệnh nhân

Hình 19: Kết quả xác định trình tự của đoạn gen đích của gia đình III (A, B, C)

Như vậy, kết quả giải trình tự đoạn DNA (8155-8366) trên hệ gen ty thể hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích bằng PCR-RFLP. Tuy nhiên, việc xác định trình tự giúp chúng tơi khẳng định chính xác đoạn nulcleotide bị mất.

Áp dụng phương pháp đã nêu ở trên (PCR-RFLP kết hợp với việc xác định trình tự, chúng tôi đã phát hiện 23 trường hợp mất đoạn 9 bp (Bảng 10, Phụ lục 2) trong tổng số 72 mẫu nghiên cứu, chiếm tỷ lệ 31,9~32%.

Bảng 10: Danh sách bệnh nhân bị đột biến mất đoạn 9 bp

STT Bệnh nhân Ghi chú STT Bệnh nhân

1 Nguyễn Đình N.

Gia đình I

7 Phạm Thanh H.

Nguyễn Đình Nh. 8 Nguyễn Thị Phương N. Đỗ Thị Gi. 9 Đào Thái S.

2 Hoàng Thị Như Q.

Gia đình II

10 Vũ Qúy M. Hoàng Văn T. 11 Đỗ Trường P. Nguyễn Thị H. 12 Lê Doãn Xuân Tr. 3 Lê Mai L.

Gia đình III

13 Trần Thanh B. Bùi Thị D. 14 Trần An N. Lê Xuân S. 15 Hà Việt H. 4 Nguyễn Thị T.

Gia đình IV

16 Trần Đình Việt D. Nguyễn Mạnh H. 17 Phạm Nhật Q. Nguyễn Hồng Đ. 18 Đinh Viê ̣t N. 5 Nguyễn Văn Đ.

Gia đình V

19 Nguyễn Văn T. Ngô Thị Ng. 20 Nguyễn Kim H. Nguyễn Minh Đ. 21 Nguyễn Hoàng A. Nguyễn Văn Đi. 22 Trần Văn H. 6 Nguyễn Thị Phương Kh. Gia đình VI 23 Nguyễn Mạnh D. Nguyễn Thành Đ. Nguyễn Đức Th. Lê Thị K.

Như vậy tần suất xuất hiện sự mất đoạn 9 bp giữa vùng COII và tRNALys ở các bệnh nhân Việt Nam nghi ngờ hội chứng cơ não ty thể là tương đối cao so với những người khỏe mạnh (chiếm tỷ lệ 20%) như được báo cáo trong nghiên cứu trước đây [18]. Kết quả này phần nào cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu về tần suất xuất hiện sự mất đoạn 9 bp trong hệ gen ty thể ở các bệnh nhân người Đài Loan mắc hội chứng MELAS và MERRF là 47% so với người khỏe mạnh là 21% [22].

Các nghiên cứu trước đây cũng đã cho rằng có sự thiếu ổn định của vùng gen COII/tRNALys trong hệ gen ty thể ở các bệnh nhân bị bệnh ty thể và là điểm nóng cho sự mất đoạn [33], mặc dầu vùng này của ty thể vốn được xem là một vùng khơng mã hóa cho protein hay enzyme nào. Do đó, có thể nó khơng phải là một đột biến gây nên bệnh tật. Nhưng tỷ lệ đột biến mất đoạn cao trong những bệnh nhân có biểu hiện rối loạn hoạt động ty thể, khiến chúng tôi nhận định hai khả năng: thứ nhất, ở bệnh nhân bị rối loạn hoạt động ty thể thì quá trình sao chép của gen ty thể bị lỗi và gây ra sự mất đoạn, đặc biệt ở những vùng trình tự lặp lại tương đồng; thứ hai, sự mất đoạn này ở người đã góp phần cho những biểu hiện bệnh đa dạng của bệnh ty thể.

3.3. Phân tích đột biến A3243A

3.3.1. Nhân đoạn gen mang đột biến A3243G

Nhằm tìm hiểu sự liên quan giữa đột biến mất đoạn 9 bp với đột biến A3243G của hội chứng MELAS, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc sự có mặt của đột biến này ở 72 bệnh nhân mà chúng tôi chọn điều tra đột biến mất đoạn 9 bp và đột biến A8344G nêu trên.

Đột biến thay thế A thành G ở vị trí 3243 làm xuất hiện trình tự nhận biết của enzyme HaeIII (AGCC → GGCC). Chúng tôi đã áp dụng phương pháp PCR-RFLP như được nêu trong nghiên cứu của Trịnh Lê Phương và tập thể [3].

Cặp mồi đặc hiệu trên (MtFw và MtRv) chứa hai vị trí nhận biết của enzyme

HaeIII và ở mồi xi 3149C được thay bằng 3149T cịn ở mồi ngược 3318G được

thay bằng 3318A (so với trình tự gốc). Với cách thiết kế như trên, cặp mồi đã loại bỏ hai trình tự nhận biết của HeaIII trong sản phẩm PCR. Vì vậy, chỉ những đoạn DNA chứa đột biến mới có vị trí nhận biết của enzyme HaeIII và bị cắt thành hai

đoạn mới, cịn đoạn DNA khơng chứa đột biến thì khơng có vị trí nhận biết của enzyme HaeIII nên khơng bị cắt và giữ ngun kích thước ban đầu. Theo tính tốn lý thuyết, PCR với cặp mồi thiết kế chúng tôi nhân bản được đoạn DNA từ vị trí 3134 đến vị trí 3331, kích thước 198 bp.

Chúng tôi sử dụng chế phẩm DNA tổng số tách từ mẫu máu của các bệnh nhân cho PCR. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% ở hình 20 cho thấy sản phẩm PCR từ các mẫu DNA tổng số tách từ máu của các bệnh nhân đều cho một băng DNA duy nhất có kích thước như tính tốn lý thuyết là 198bp. Trong khi đó, sản phẩm PCR của mẫu khơng có DNA khơng cho băng DNA nào cả.

198bp

1 2 3 4 5 6 7 8

Hình 20: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose

Đường chạy 1: Thang chuẩn

DNA 100 bp, 2: Đối chứng âm (khơng có khn DNA), 3→8: Sản phẩm PCR với DNA khuôn từ một số bệnh nhân.

3.3.2. Phát hiện đột biến A3243G bằng PCR-RFLP

Sau khi kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 2%, chúng tôi đã tiến hành cắt trực tiếp các sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn HaeIII, sản phẩm của phản ứng cắt giới hạn được điện di trên gel polyacrylamide 15% và thu được kết quả điện di ở hình 21.

Theo lý thuyết, enzyme HaeIII cắt đoạn DNA kích thước 198 bp chứa đột

biến A3243G thành hai đoạn mới có kích thước 111 bp và 87 bp. Cịn đoạn DNA khơng chứa đột biến không bị enzyme HaeIII cắt và giữ nguyên kích thước ban đầu 198 bp. Dựa vào phổ băng DNA thu được chúng ta có thể kết luận đoạn DNA có mang đột biến hay không.

Đối chứng dương được cắt từ DNA khuôn bệnh nhân bị đột biến A3243G xác định trong nghiên cứu Trịnh Lê Phương và tập thể [3] sau khi cắt bằng HaeIII đều cho 3 băng DNA là 198 bp, 111 bp và 87 bp. Đột biến này đã được nhóm nghiên cứu giải trình tự và khẳng định phương pháp xác định đột biến A3243G bằng PCR-RFLP là hồn tồn chính xác.

Hình 21: Kết quả điện di sản phẩm PCR cắt bằng HaeIII trên gel polyacrylamide

Đường chạy 1: Thang chuẩn DNA Low Range, 2: Đối chứng âm (sản phẩm PCR không cắt bằng HaeIII ), 3: Đối chứng dương. 4: Bệnh nhân Nguyễn Văn Đ. (thuộc gia đình V), 5→10: Các bệnh nhân khác.

Tương tự như vậy, dựa vào đối chứng dương đã biết, từ 72 mẫu bệnh nhân được điều tra, chúng tôi phát hiện ra một trường hợp một bệnh nhân bị đột biến A3243G (hình 21, đường chạy 4) và bệnh nhân này nằm trong số 23 bệnh nhân mang đột biến mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA đã được điều tra ở trên. Đột biến A thay thế G ở vị trí 3243 nằm trên gen mã hóa cho tRNALeu(UUR)

thuộc hội chứng não

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

198 111 87

giật cơ, tăng lactate máu và giả tai biến mạch (MELAS). Bệnh nhân này là một trẻ nam 11 tuổi (Nguyễn Văn Đ., Hải Hậu-Nam Định), có biểu hiện rối loạn chuyển hóa ty thể đặc trưng nhất là hàm lượng acid lactic máu rất cao 9,2 mmol/L so với