STT Bệnh nhân Ghi chú STT Bệnh nhân
1 Nguyễn Đình N.
Gia đình I
7 Phạm Thanh H.
Nguyễn Đình Nh. 8 Nguyễn Thị Phương N. Đỗ Thị Gi. 9 Đào Thái S.
2 Hoàng Thị Như Q.
Gia đình II
10 Vũ Qúy M. Hồng Văn T. 11 Đỗ Trường P. Nguyễn Thị H. 12 Lê Doãn Xuân Tr. 3 Lê Mai L.
Gia đình III
13 Trần Thanh B. Bùi Thị D. 14 Trần An N. Lê Xuân S. 15 Hà Việt H. 4 Nguyễn Thị T.
Gia đình IV
16 Trần Đình Việt D. Nguyễn Mạnh H. 17 Phạm Nhật Q. Nguyễn Hồng Đ. 18 Đinh Viê ̣t N. 5 Nguyễn Văn Đ.
Gia đình V
19 Nguyễn Văn T. Ngô Thị Ng. 20 Nguyễn Kim H. Nguyễn Minh Đ. 21 Nguyễn Hoàng A. Nguyễn Văn Đi. 22 Trần Văn H. 6 Nguyễn Thị Phương Kh. Gia đình VI 23 Nguyễn Mạnh D. Nguyễn Thành Đ. Nguyễn Đức Th. Lê Thị K.
Như vậy tần suất xuất hiện sự mất đoạn 9 bp giữa vùng COII và tRNALys ở các bệnh nhân Việt Nam nghi ngờ hội chứng cơ não ty thể là tương đối cao so với những người khỏe mạnh (chiếm tỷ lệ 20%) như được báo cáo trong nghiên cứu trước đây [18]. Kết quả này phần nào cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu về tần suất xuất hiện sự mất đoạn 9 bp trong hệ gen ty thể ở các bệnh nhân người Đài Loan mắc hội chứng MELAS và MERRF là 47% so với người khỏe mạnh là 21% [22].
Các nghiên cứu trước đây cũng đã cho rằng có sự thiếu ổn định của vùng gen COII/tRNALys trong hệ gen ty thể ở các bệnh nhân bị bệnh ty thể và là điểm nóng cho sự mất đoạn [33], mặc dầu vùng này của ty thể vốn được xem là một vùng khơng mã hóa cho protein hay enzyme nào. Do đó, có thể nó khơng phải là một đột biến gây nên bệnh tật. Nhưng tỷ lệ đột biến mất đoạn cao trong những bệnh nhân có biểu hiện rối loạn hoạt động ty thể, khiến chúng tôi nhận định hai khả năng: thứ nhất, ở bệnh nhân bị rối loạn hoạt động ty thể thì quá trình sao chép của gen ty thể bị lỗi và gây ra sự mất đoạn, đặc biệt ở những vùng trình tự lặp lại tương đồng; thứ hai, sự mất đoạn này ở người đã góp phần cho những biểu hiện bệnh đa dạng của bệnh ty thể.
3.3. Phân tích đột biến A3243A
3.3.1. Nhân đoạn gen mang đột biến A3243G
Nhằm tìm hiểu sự liên quan giữa đột biến mất đoạn 9 bp với đột biến A3243G của hội chứng MELAS, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc sự có mặt của đột biến này ở 72 bệnh nhân mà chúng tôi chọn điều tra đột biến mất đoạn 9 bp và đột biến A8344G nêu trên.
Đột biến thay thế A thành G ở vị trí 3243 làm xuất hiện trình tự nhận biết của enzyme HaeIII (AGCC → GGCC). Chúng tôi đã áp dụng phương pháp PCR-RFLP như được nêu trong nghiên cứu của Trịnh Lê Phương và tập thể [3].
Cặp mồi đặc hiệu trên (MtFw và MtRv) chứa hai vị trí nhận biết của enzyme
HaeIII và ở mồi xi 3149C được thay bằng 3149T cịn ở mồi ngược 3318G được
thay bằng 3318A (so với trình tự gốc). Với cách thiết kế như trên, cặp mồi đã loại bỏ hai trình tự nhận biết của HeaIII trong sản phẩm PCR. Vì vậy, chỉ những đoạn DNA chứa đột biến mới có vị trí nhận biết của enzyme HaeIII và bị cắt thành hai
đoạn mới, cịn đoạn DNA khơng chứa đột biến thì khơng có vị trí nhận biết của enzyme HaeIII nên không bị cắt và giữ ngun kích thước ban đầu. Theo tính tốn lý thuyết, PCR với cặp mồi thiết kế chúng tôi nhân bản được đoạn DNA từ vị trí 3134 đến vị trí 3331, kích thước 198 bp.
Chúng tôi sử dụng chế phẩm DNA tổng số tách từ mẫu máu của các bệnh nhân cho PCR. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% ở hình 20 cho thấy sản phẩm PCR từ các mẫu DNA tổng số tách từ máu của các bệnh nhân đều cho một băng DNA duy nhất có kích thước như tính tốn lý thuyết là 198bp. Trong khi đó, sản phẩm PCR của mẫu khơng có DNA khơng cho băng DNA nào cả.
198bp
1 2 3 4 5 6 7 8
Hình 20: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose
Đường chạy 1: Thang chuẩn
DNA 100 bp, 2: Đối chứng âm (khơng có khn DNA), 3→8: Sản phẩm PCR với DNA khuôn từ một số bệnh nhân.
3.3.2. Phát hiện đột biến A3243G bằng PCR-RFLP
Sau khi kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 2%, chúng tôi đã tiến hành cắt trực tiếp các sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn HaeIII, sản phẩm của phản ứng cắt giới hạn được điện di trên gel polyacrylamide 15% và thu được kết quả điện di ở hình 21.
Theo lý thuyết, enzyme HaeIII cắt đoạn DNA kích thước 198 bp chứa đột
biến A3243G thành hai đoạn mới có kích thước 111 bp và 87 bp. Cịn đoạn DNA khơng chứa đột biến khơng bị enzyme HaeIII cắt và giữ ngun kích thước ban đầu 198 bp. Dựa vào phổ băng DNA thu được chúng ta có thể kết luận đoạn DNA có mang đột biến hay khơng.
Đối chứng dương được cắt từ DNA khuôn bệnh nhân bị đột biến A3243G xác định trong nghiên cứu Trịnh Lê Phương và tập thể [3] sau khi cắt bằng HaeIII đều cho 3 băng DNA là 198 bp, 111 bp và 87 bp. Đột biến này đã được nhóm nghiên cứu giải trình tự và khẳng định phương pháp xác định đột biến A3243G bằng PCR-RFLP là hồn tồn chính xác.
Hình 21: Kết quả điện di sản phẩm PCR cắt bằng HaeIII trên gel polyacrylamide
Đường chạy 1: Thang chuẩn DNA Low Range, 2: Đối chứng âm (sản phẩm PCR không cắt bằng HaeIII ), 3: Đối chứng dương. 4: Bệnh nhân Nguyễn Văn Đ. (thuộc gia đình V), 5→10: Các bệnh nhân khác.
Tương tự như vậy, dựa vào đối chứng dương đã biết, từ 72 mẫu bệnh nhân được điều tra, chúng tôi phát hiện ra một trường hợp một bệnh nhân bị đột biến A3243G (hình 21, đường chạy 4) và bệnh nhân này nằm trong số 23 bệnh nhân mang đột biến mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA đã được điều tra ở trên. Đột biến A thay thế G ở vị trí 3243 nằm trên gen mã hóa cho tRNALeu(UUR)
thuộc hội chứng não
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
198 111 87
giật cơ, tăng lactate máu và giả tai biến mạch (MELAS). Bệnh nhân này là một trẻ nam 11 tuổi (Nguyễn Văn Đ., Hải Hậu-Nam Định), có biểu hiện rối loạn chuyển hóa ty thể đặc trưng nhất là hàm lượng acid lactic máu rất cao 9,2 mmol/L so với người bình thường là 1,0 - 1,78 mmol/L. Dấu hiệu về thần kinh cũng khá rõ nét cho hội chứng MELAS: bệnh nhân có biểu hiện bị động kinh co giật nặng, run tay phải, co giật chân phải, hay bị co giật dẫn đến liệt nửa người và hồi phục chậm, trong cơn co giật vẻ mặt đờ đẫn mất ý thức. Phát triển tinh thần vận động chậm, tay chân nhỏ, người cao và rất gầy (trọng lượng cơ thể là 18 kg, so với bình thường là khoảng 25 kg). Kết quả chụp cộng hưởng từ cho thấy bệnh nhân bị viêm não, hình ảnh tổn thương viêm não thùy thái dương trái và thùy chẩm hai bên. Những tổn thương này là phổ biến trong hội chứng Melas với đột biến A3243G, nhiều nghiên cứu đã cho rằng sự mất chức năng ty thể góp phần cho những phá hủy thần kinh trong hội chứng Melas [38]. Kiểm tra sau khi đo thính lực thấy khả năng nghe kém. Hàm lượng Ca2+ là 0,95 mmol/L giảm so với mức bình thường là 1,1-1,3 mmol/L, có thể do nhiều ty thể bị hỏng làm giảm khả năng tích trữ và lưu giữ lượng ion Ca2+ trong máu bệnh nhân.
Bệnh nhân này có thể trạng gầy yếu, mệt mỏi, rất biếng ăn, nuốt khó và thường bị nôn sau ăn. Kết quả kiểm tra các cơ quan khác như hơ hấp, tiêu hóa, cơ-xương khớp, thị lực khơng phát hiện gì đặc biệt. Các chỉ tiêu sinh hóa máu khác đều trong mức bình thường. Kết quả phát hiện các virus EV, EBV, CMV, HSV1 cho kết quả âm tính.
Chúng tơi cũng đã kiểm tra sự có mặt của đột biến A3243G trong các thành viên gia đình bệnh nhân Nguyễn Văn Đ. Kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP (hình 22) cho thấy sản phẩm PCR với mẫu DNA khuôn của bố bệnh nhân sau khi cắt bằng HaeIII chỉ cho một băng DNA duy nhất kích thước 198bp (hình 22, đường chạy 7) giống như sản phẩm PCR trước khi cắt bằng HaeIII (hình22, đường chạy
2). Trong khi đó sản phẩm PCR với mẫu DNA khn của bệnh nhân, mẹ và anh trai bệnh nhân (hình 22, đường chạy 4, 5, 6) thì sau khi cắt bằng HaeIII đều cho 3 băng DNA giống như mẫu đối chứng dương (hình 22, đường chạy 3). Dựa vào thang chuẩn DNA, các băng này có kích thước như tính tốn lý thuyết là 87 bp, 111 bp và 198 bp. Kết quả này chứng tỏ bố bệnh nhân khơng mang đột biến A3243G, cịn mẹ bệnh nhân, anh trai bệnh nhân và bệnh nhân đều mang đột biến A3243G. Điều này một lần nữa cũng khẳng định mẹ của bệnh nhân đã truyền đột biến A3243G cho con.
Hình 22: Kết quả điện di sản phẩm PCR cắt bằng HaeIII trên gel polyacrylamide
Đường chạy 1: thang chuẩn DNA Low Range, 2: đối chứng âm (sản phẩm PCR không cắt HaeIII), 3: đối chứng dương, 4: Bệnh nhân Đ., 5: anh bệnh nhân Đ., 6: mẹ bệnh nhân Đ, 7: bố bệnh nhân Đ.
Sự tồn tại của băng DNA có kích thước ban đầu 198 bp ở các sản phẩm cắt của mẫu bệnh nhân, anh và mẹ bệnh nhân (hình 22) được lý giải bằng hiện tượng heteroplasmy. Cơ thể mang đột biến A3243G chứa đồng thời bản copy có đột biến và bản copy khơng có đột biến nên sản phẩm PCR có chứa cả đoạn DNA mang đột biến và đoạn DNA khơng mang đột biến. Do đó, sản phẩm PCR-RFLP của mẫu mẹ, anh trai bệnh nhân và bệnh nhân vẫn có băng 198 bp.
Thêm nữa, dựa vào độ sáng của các băng DNA ở sản phẩm cắt của bệnh nhân, anh và mẹ bệnh nhân (hình 22) chúng tôi đưa ra nhận định rằng: tỉ lệ sản phẩm PCR bị cắt bởi enzyme HaeIII ở mẹ bệnh nhân thấp hơn so với hai người con rất nhiều, điều đó cho thấy tỉ lệ ty thể mang đột biến A3243G/ty thể không mang đột biến ở mẹ bệnh nhân thấp hơn hai người con. Nhận định này phần nào giải thích được bệnh nhân có biểu hiện của hội chứng MELAS rõ rệt, còn mẹ bệnh nhân thì khơng có các biểu hiện bệnh.
Như vậy, có thể thấy rằng bệnh nhân Nguyễn Văn Đ. mang đồng thời đột biến mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA và đột biến MELAS A3243G.
Mất đoạn 9 bp có thể là một yếu tố nhạy cảm cho những bệnh rối loạn đa yếu tố liên quan đến ty thể. Dựa trên phương pháp chẩn đốn bệnh ty thể gồm có các xét nghiệm lâm sàng, cận lâm sàng và xét nghiệm phân tử. Các xét nghiệm lâm sàng và cận lâm sàng gồm có chỉ số lactate, nồng độ protein dịch não tủy (CSF), điện tâm đồ, điện cơ, sinh thiết cơ, xét nghiệm hóa sinh các enzyme của chuỗi hô hấp. Xét nghiệm phân tử gồm kiểm tra sự tồn tại của các đột biến trên mtDNA.
bp
1 2 3 4 5 6 7
198 111 87
Theo các dẫn liệu Bệnh viện Nhi Trung ương cung cấp, chúng tôi thấy những bệnh nhân mất đoạn 9 bp chúng tơi phát hiện được đều thuộc nhóm có hàm lượng axit lactic trong máu cao (bảng 11).
Bảng 11: Hàm lƣợng axit lactic trong máu bệnh nhân bị mất đoạn 9 bp
STT Họ và tên bệnh nhân Tuổi Axit lactic máu
1 Hoàng Thị Như Q. 13 Th 20,3 mmol/L
2 Nguyễn Văn Đ. 11 T 9,2 mmol/L
3 Nguyễn Đình Ng. 7 Th 6,3 mmol/L
4 Trần An N. 40 Ng 6,3 mmol/L
5 Nguyễn Văn T. 2,5 T 5,7 mmol/L
6 Đỗ Trường P. 2 T 5,5 mmol/L
7 Trần Thanh B. 4,5 Th 5,4 mmol/L
8 Trần Văn H. 15 T 4,3 mmol/L
9 Nguyễn Thị Phương Kh. 12 T 4,2 mmol/L
10 Nguyễn Thị Th. 7 Th 4,0 mmol/l
11 Nguyễn Mạnh D. 14 Th 3,9 mmol/L
12 Vũ Qúy M. 10 Th 3,6 mmol/L
13 Đào Thái S. 3, 5 Th 3,6 mmol/L
14 Lê Doãn Xuân Tr. 17 Th 3,4 mmol/L
15 Đinh Viê ̣t N. 10 T 3,0 mmol/L
16 Lê mai L. 10 T 2,7 mmol/L
17 Phạm Thanh H. 4 T 2,7 mmol/L
18 Hà Việt Hoàng 4 T 2,4 mmol/L
19 Nguyễn Thị Phương N. 25 Th 2,2 mmol/L
Ngƣời bình thƣờng 1,0 - 1,78 mmol/L
Axit lactic là một hợp chất hữu cơ sinh học, nó được sản sinh từ quá trình đường phân (glycolysis). Hầu hết các cơ quan, tổ chức trong cơ thể duy trì hoạt động nhờ vào q trình cung cấp năng lượng hiếu khí. Tuy nhiên khi ty thể bị hỏng thì tế bào sử dụng toàn phần hay một phần năng lượng từ nguồn oxy hóa glucose yếm khí và sản sinh axit lactic khuếch tán vào máu.
Vì đột biến mất đoạn 9 bp khơng thuộc vùng gen mã hóa cho một RNA hay protein nào, nên không phải là nguyên nhân trực tiếp gây nên các rối loạn chức
năng ty thể. Các rối loạn như tăng axit lactic máu và biểu hiện bất bình thường về thần kinh và vận động (không nêu ở đây) của các bệnh nhân được điều tra rất có thể liên quan đến sự có mặt của đột biến khác trong hệ gen ty thể mà chưa được phát hiện thấy trong nghiên cứu của chúng tôi. Tỷ lệ đột biến mất đoạn 9 bp cao (32%) hơn mức người bình thường trong nghiên cứu của chúng tơi có thể nói lên rằng, có sự liên quan nhất định giữa mất đoạn 9 bp với khả năng bị các đột biến khác trong hệ gen ty thể.
Kết luận và kiến nghị
Kết luận
1. Đã thiết lập được quy trình phân tích đột biến mất đoạn 9 bp
CCCCCTCTA nằm ở vùng khơng mã hóa giữa gen mã hóa cho tRNALys và vùng COII trong hệ gen ty thể người.
2. Đã điều tra sự có mặt của đột biến mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA ở 72
bệnh nhân nghi bị bệnh ty thể và phát hiện thấy tần số mất đoạn 9 bp này trong những bệnh nhân nghi bị bệnh ty thể Việt Nam 32% và đột biến được di truyền từ mẹ sang con.
3. Những bệnh nhân mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA đều có những biểu hiện
của sự rối loạn hoạt động ty thể, đặc trưng bởi chỉ số lactate máu tăng rất cao và có triệu chứng bệnh về thần kinh.
4. Đã phát hiện được 01 bệnh nhân mang đột biến mất đoạn 9 bp đồng thời
mang đột biến A3243G thuộc hội chứng MELAS, và không phát hiện thấy bệnh nhân nào trong số 72 bệnh nhân được điều tra mang đột biến A8344G.
Kiến nghị
1. Áp dụng quy trình phân tích đột biến mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA thiết
lâ ̣p được với số lượng mẫu lớn hơn kèm theo xác đi ̣nh mô ̣t số đô ̣t biến gen ty thể khác để tìm mối liên quan giữa sự mất đoa ̣n 9 bp và khả năng bị đột biến khác , làm cơ sở cho các tư vấn về sức khỏe và điều tri ̣.
2. Nghiên cứu tần số mất đoạn 9 bp ở các tộc người Việt Nam nhằm xác định mối quan hệ di truyền tiến hóa và di cư.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
1. Đái Duy Ban, Lê Thanh Hịa, Nguyễn Văn Vũ, Hồng Minh Châu, Nguyễn Bích Nga, Đái Hằng Nga, Lê Kim Xuyến, Đoàn Thanh Hương, Phạm Công Hoạt, Phan Xuân Đọc, Lê Trung Dũng, Lê Quang Huấn, Nguyễn Thanh Đạm, Nguyễn Bá Đức, Nguyễn Công Hoàng (2003), “Bước đầu nghiên cứu ung thư vú bệnh nhân Việt Nam bằng phương pháp sinh học phân tử sử dụng chỉ thị di truyền hệ gen ty thể vùng D-loop”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự
sống, Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ hai, Nghiên cứu cơ bản trong sinh học, nông nghiệp, y học, Huế 25-26/7/2003, Nhà xuất bản
Khoa học và kỹ thuật, Hà nội, tr. 825-829.
2. Lê Quang Huấn, Trần Mỹ Linh, Vũ Thị Thư, Phan Minh Tuấn, Lê Trần Bình (2003), “Nghiên cứu giám định phả hệ bằng kỹ thuật DNA”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ hai, Nghiên cứu cơ bản trong sinh học, nông nghiệp, y học, Huế 25-26/7/2003, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà nội, tr. 917-919.