STT Tên thiết bị Hãng sản xuất
1 Tủ an toàn sinh học Esco (Mỹ)
2 Tủ nuôi vi sinh điều khiển nhiệt độ BioSan (Latvia) 3 Máy nghiền đồng thể mô thực vật
4 Máy làm khô chân không Eppendorf (Đức)
5 Máy ly tâm lạnh 5415 D/R Eppendorf (Đức)
6 Máy PCR Eppendorf (Đức)
7 Nguồn điện di
8 Bể điện di Optima (Nhật)
9 Máy ổn nhiệt Eppendorf (Đức)
10 Tủ lạnh –20C và –80C
11 Máy soi gel UV UVP (Đức)
12 Máy đo pH WTW (Đức)
13 Máy đo mật độ quang học Eppendorf (Đức)
Ngồi ra, cịn các thiết bị khác phục vụ cho quá trình nghiên cứu như cân phân tích, cân kỹ thuật, máy vortex, máy minispin, lị vi sóng, thiết bị khử trùng…
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu được tiến hành theo quy trình như sau:
2.2.1. Tìm kiếm các gen mã hóa cho enzyme methionine sulfoxide reductase A trong hệ gen của cây đậu tương (GmMSRA) trong hệ gen của cây đậu tương (GmMSRA)
Dùng trình tự peptide mã hóa cho MSRA đã biết của cây mơ hình
Arabidopsis thaliana làm trình tự mẫu để tìm kiếm các GmMSRA sử dụng cơ sở dữ
liệu PHYTOZOME (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html).
Xác định các gen được hình thành do hiện tượng nhân đôi hệ gen (genome duplication) theo phương pháp của Tang [54] và dự đốn vị trí đích của các protein
GmMSRA được vận chuyển đến trong tế bào theo tính tốn của Emanuelsson [17].
2.2.2. Đánh giá mức độ biểu hiện của các GmMSRA
2.2.2.1. Mức độ biểu hiện ở các mô cơ quan và điều kiện sinh trưởng khác nhau
Sử dụng cơ sở dữ liệu của Libault [37] để xây dựng đồ thì đánh giá mức độ biểu hiện của các GmMSRA ở các mô khác nhau trên cây đậu tương.
Sử dụng mã định dạng của các GmMSRA để tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu
GENEVESTIGATOR (https://genevestigator.com/gv/) [26] nhằm đánh giá mức độ phiên mã của chúng ở các mô khác nhau trong các điều kiện khác nhau.
2.2.2.2. Đánh giá biểu hiện gen trong điều kiện bình thường và bất lợi.
Sử dụng dữ liệu của Le và cs (dữ liệu của thành viên trong nhóm nghiên cứu và chưa được cơng bố) để đánh giá mức độ biểu hiện của các GmMSRA trong điều kiện bình thường và điều kiện khơ hạn. Thử nghiệm này được tiến hành theo quy trình như sau: Cây đậu tương được trồng trong chậu có kích thước 6 lít (mỗi chậu 3 cây) có chứa “supermix” đến giai đoạn V6 (đã có trifolia thứ 7, 28 ngày sau gieo hạt) thì dừng tưới nước với cây xử lý hạn. Đến ngày thứ 6 của việc dừng tưới nước thì thu lá trifolia thứ 8. Lúc này trifolia thứ 8 đã mở được 1/2 và cây chuẩn bị nở hoa [34]. Mẫu lá sau khi thu được làm lạnh nhanh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở ‒ 80°C cho đến khi tách ARN để xác định biểu hiện gen. Tinh sạch ARN và tổng hợp cADN cũng như phân tích PCR định lượng được thực hiện theo qui trình đã cơng bố trước đây [33].
2.2.3. Xác định đặc tính của các GmMSRA thơng qua biểu hiện trên nấm men
Saccharomyces cerevisiae.
2.2.3.1. Kỹ thuật tách dịng gen
Quy trình
Tách chiết và tinh sạch ARN tổng số sử dụng hóa chất TriPure Isolation Reagent (Roche, Mỹ).
Xử lý mẫu ARN với DNAse I để loại bỏ ADN.
Tổng hợp cADN sử dụng KIT GoscriptTM Reverse Transcription System
(Promega, Mỹ) với mồi hexamer ngẫu nhiên.
Thiết kế cặp mồi đặc hiệu sử dụng cho phản ứng PCR để nhân dịng đoạn cADN mã hóa cho gen quan tâm. PCR được thực hiện với enzyme Pwo DNA polymerase (Roche). Thông tin mồi, thành phần phản ứng, chu trình nhiệt được trình bày trong bảng 2.3, 2.4 và 2.5.
Đưa gen đích vào vector tách dòng pKS rồi chuyển tiếp sang vector biểu hiện nấm men p425.
Biến nạp vector p425 mang gen mã hóa cho GmMSRA vào chủng nấm men ∆3MSR sử dụng KIT FastTM – Yeast Transformation và ni cấy trên mơi trường
khơng có Met có bổ sung MetO.