Vector pGreen mang cấu trúc 35S::MSRA6 sau khi được biến nạp vào vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã tiếp tục được biến nạp vào cây mơ hình A. thaliana sử dụng kĩ thuật nhúng hoa (Clough and Bent, 1998). Bằng phương pháp
này, chúng tôi đã biến nạp thành công GmMSRA6 dưới sự điều khiển của promoter 35S vào cây mơ hình Arabidopsis thaliana kiểu dại (Col-0). Cây chuyển gen mang gen chỉ thị kháng kháng sinh kanamycin do đó có khả năng nảy mầm và sống sót trên mơi trường chọn lọc (1/2 MS, kan 30 mg/l), trong khi cây không mang gen chuyển nảy mầm và sau đó chết trắng trên mơi trường chọn lọc. Kết quả tạo cây mơ hình siêu biểu hiện GmMSRA6 được minh họa trong hình 3.16.
Hình 3.16. Tạo cây chuyển gen bằng phương pháp nhúng hoa và chọn lọc trên mơi trường ½ MS, kanamycin 30 mg/L.
3.4.2. Kết quả tách chiết ADN tổng số cây chuyển gen.
Để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trên các cây Arabidopsis thu được,
chúng tôi tiến hành tách ADN phục vụ cho việc phân tích bằng PCR. Sử dụng kit tách chiết ADN GeneAll® ExgeneTM Plant, chúng tôi đã tách chiết được ADN từ
mẫu mô của cây kiểu dại và cây chuyển gen. Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1,3%, nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới tia cực tím ở bước sóng 245 nm. Kết quả điện di được minh họa trong được minh họa trong hình 3.17.
Hình 3.17. Điện di kiểm tra ADN tổng số được tách chiết từ cây chuyển gen A. thaliana (gel agarose 0,8%, nhuộm ethidium bromide)
Giếng 1: ADN tổng số cây A. thaliana kiểu dại; Giếng 2 - 5: ADN tổng số cây A. thaliana mang gen mã hóa
enzyme GmMSRA6
Hình ảnh điện di và nhuộm ethidium bromide cho thấy các băng ADN tổng số tương đối sáng, gọn chứng tỏ hàm lượng ADN trong mẫu khá cao, ít bị đứt gãy và sạch. Mẫu số 2 dù có biểu hiện đứt gãy nhưng cả 5 mẫu đều đủ điều kiện để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.3. Kết quả PCR mẫu ADN tổng số cây chuyển gen nhằm phát hiện sự có mặt của gen chuyển. mặt của gen chuyển.
Để phát hiện sự có mặt của gen chuyển GmMSRA6, chúng tơi tiến hành phản ứng PCR sử dụng cặp mồi bắt cặp đặc hiệu với trình tự 35S promoter và Nos terminator nằm trên cấu trúc T-DNA của pGreen. Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1,3%, nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới tia cực tím ở bước sóng 245 nm. Kết quả điện di được minh họa trong hình 3.18 cho thấy:
Giếng 1: đối chứng âm (sử dụng nước tinh khiết thay cho ADN) không xuất hiện băng, chứng tỏ hỗn hợp phản ứng PCR không bị nhiễm tạp.
Giếng 2: sử dụng ADN tổng số của cây kiểu dại làm khuôn cho phản ứng PCR, kết quả điện di không thấy xuất hiện băng, chứng tỏ cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR đặc hiệu cho gen chuyển GmMSRA6.
Giếng 3, 4, 6, 7: sử dụng ADN tổng số của cây chuyển gen làm khuôn cho phản ứng PCR, băng ADN thu được có kích thước mong đợi, sáng và rõ nét, chứng tỏ chúng tôi đã thành công trong việc tạo ra cây mơ hình siêu biểu hiện GmMSRA6. Do đó,
chúng tơi sử dụng dịng cây chuyển gen này cho các thí nghiệm phân tích tiếp theo.
Hình 3.18. Điện di sản phẩm PCR mẫu ADN tổng số cây chuyển gen (gel agarose 1,3%, nhuộm ethidium bromide)
3.4.4. Xác định sự biểu hiện của gen chuyển bằng RT-PCR
Nhằm kiểm tra gen chuyển có được phiên mã thành ARN và biểu hiện trong tế bào hay không? Chúng tơi tách chiết ARN tổng số sử dụng hóa chất Tripure từ các cây A. thaliana 14 ngày tuổi, được trồng trên đĩa thạch mơi trường ½ MS,
kanamycin 30 mg/L (dòng cây đối chứng và dòng cây chuyển gen 35S::GmMSRA6). Đoạn cADN được tổng hợp sử dụng KIT GoscriptTM Reverse Transcription System (Promega, Mỹ) với mồi hexamer ngẫu nhiên, sau đó thực hiện
phản ứng PCR với mồi đặc hiệu cho GmMSRA6. Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1,3%, nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới tia cực tím ở bước sóng 245 nm. Kết quả được minh họa trên hình 3.19.
Hình 3.19. Điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR trên gel agarose 1.3%, nhuộm ethidium bromide
Giếng 1: Thang chuẩn 1 kb; Giếng 2: Đối chứng (-); Giếng 3,4: sản phẩm RT-PCR cADN từ mẫu lá cây đối
chứng; Giếng 5, 6: sản phẩm RT-PCR cADN từ mẫu lá cây chuyển gen 35S::GmMSRA6-1; Giếng 7: giếng trống; Giếng 8, 9: sản phẩm RT-PCR cADN mẫu lá cây chuyển gen 35S::GmMSRA6-2.
Kết quả điện di cho thấy: Giếng 2: đối chứng âm (sử dụng nước tinh khiết thay cho khuôn) khơng xuất hiện băng, chứng tỏ thí nghiệm khơng bị nhiễm ADN lạ. Giếng 3, 4: sử dụng cADN của cây đối chứng làm khuôn, kết quả điện di không thấy xuất hiện băng, chứng tỏ cặp mồi sử dụng cho phản ứng RT-PCR đặc hiệu cho gen chuyển GmMSRA6.
Giếng 5, 6, 8, 9: sử dụng cADN của cây chuyển gen làm khuôn cho phản ứng RT- PCR, băng ADN thu được có kích thước mong đợi (206 nucleotide), sáng và rõ nét, chứng tỏ gen chuyển có được phiên mã thành ARN và biểu hiện trong tế bào.
3.4.5. Kết quả xác định tỷ lệ đồng hợp/dị hợp của các dòng cây chuyển gen ở thế hệ F3 thế hệ F3
Các cây mơ hình A. thaliana chuyển gen GmMSRA6 sau khi được chọn lọc
trên môi trường kháng sinh và kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng phản ứng PCR đã được trồng trên giá thể đất và thu hạt đến thế hệ F3. Hạt chuyển gen F3 được khử trùng (1 lần dung dịch C2H5OH 70%, 2 lần dung dịch NaClO 1% và rửa nước 5 lần) và gieo đồng thời trên mơi trường ½ MS có và khơng có kháng sinh kanamycin để xác định tỷ lệ đồng hợp/ dị hợp. Kết quả thí nghiệm được minh họa trong hình 3.21, 3.22 và 3.23. Như vậy, với tỷ lệ nảy mầm đồng đều trên cả 2 môi trường và không xuất hiện cây bị chết trắng sau khi nảy mầm (hình 3.20), qua 3 thế hệ trồng và thu hạt chúng tơi đã có được các dịng cây chuyển gen 35S::GmMSRA6 và dòng cây đối chứng (vector control) đồng hợp tử để sử dụng cho các phân tích tiếp theo. Tuy nhiên sức nảy mầm và phát triển của các hạt trên mỗi đĩa thí nghiệm và mỗi dịng cây có sự khác biệt nhất định, phụ thuộc vào độ lép và mẩy của hạt thu được.
Hình 3.20. Hình thái cây mang gen chuyển (A) và không mang gen chuyển (B) ở giai đoạn 10 ngày tuổi
Dòng cây đối chứng (Vector control)
Hình 3.21. Dịng cây đối chứng ở thế hệ F3
Hình A: Cây đối chứng 10 ngày tuổi trên mơi trường ½ MS.
Hình B, C, D: Cây đối chứng 10 ngày tuổi trên mơi trường ½ MS, kanamycin 30
Dịng cây chuyển gen 35S::GmMSRA6-1
Hình 3.22. Dịng cây chuyển gen 35S::GmMSRA6-1 ở thế hệ F3
Hình A: Cây chuyển gen 10 ngày tuổi trên mơi trường ½ MS.
Hình B, C, D: Cây chuyển gen 10 ngày tuổi trên mơi trường ½ MS, kanamycin 30
Dịng cây chuyển gen 35S::GmMSRA6-2
Hình 3.23. Dịng cây chuyển gen 35S::GmMSRA6-2 ở thế hệ F3
Hình A: Cây chuyển gen 10 ngày tuổi trên mơi trường ½ MS.
Hình B, C, D: Cây chuyển gen 10 ngày tuổi trên mơi trường ½ MS, kanamycin 30
3.4.6.1. Hình thái cây trên đĩa thạch
Gieo 2 dòng hạt chuyển gen 35S::GmMSRA6 và hạt đối chứng (Vector control) trên mơi trường ½ MS, bổ sung kanamycin 30 mg/L. Đĩa cây được đặt trong phịng ni ở nhiệt độ 22-24°C, chiếu sáng 16/24 giờ. Quan sát hình thái cây trong đĩa thạch MS ở các giai đoạn 7 và 14 ngày tuổi. Kết quả được minh họa trong hình 3.24
Hình 3.24. Hình thái các dịng cây chuyển gen trên đĩa thạch ở các giai đoạn tuổi khác nhau
Chọn các cây 10 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên mơi trường ½ MS chuyển sang giá thể đất, đặt trong phịng ni ở nhiệt độ 22-24°C, độ ẩm 70-80%, chiếu sáng 16/24 giờ. Sự thay đổi hình thái cây trên giá thể đất được ghi nhận ở giai đoạn 3, 4 và 5 tuần tuổi. Kết quả được minh họa trong hình 3.25.
Hình 3.25. Hình thái các dịng cây chuyển gen trên giá thể đất ở các giai đoạn tuổi khác nhau
Kết quả kiểm tra hình thái cây chuyển gen trên mơi trường thạch MS và giá thế đất cho thấy việc siêu biểu hiện gen GmMSRA6 trên cây A. thaliana không làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây.
Gieo 2 dòng hạt chuyển gen 35S::GmMSRA6 và hạt đối chứng (Vector control) trên mơi trường ½ MS, bổ sung kanamycin 30 mg/L. Chọn các cây có kích thước tương đương nhau ở giai đoạn 14 ngày tuổi chuyển sang 2 loại môi trường: (i) Mơi trường ½ MS, kanamycin 30 mg/L, có bổ sung NaCl ở nồng độ 200 mM: đĩa thử nghiệm NaCl, lặp lại 3 lần. (ii) Mơi trường ½ MS, kanamycin 30 mg/L: đĩa đối chứng. Đếm các cây sống sót trên mơi trường NaCl bắt đầu từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 7.
Hình 3.26. Đĩa cây đối chứng mơi trường ½ MS, kanamycin 30 mg/ L
Số ngày cây trên môi trường đối chứng (½ MS, kanamycin 30 mg/ L) được đánh số từ 2 - 7 trên hình.
Hình 3.27. Thử nghiệm kháng mặn trên dòng cây đối chứng và dòng cây chuyển gen
Số ngày cây trên mơi trường ½ MS, kanamycin 30 mg/ L, NaCl 200 mM được đánh số từ 1 – 8 trên hình.
Kết quả thử nghiệm kháng mặn ở nồng độ NaCl 200 mM (hình 3.26 và hình 3.27) cho thấy cả dòng cây đối chứng (vector trống) và dòng cây chuyển gen
35S::GmMSRA6 (vector mang gen mã hóa GmMSRA6) đều có biểu hiện đáp ứng
nhạy cảm trong điều kiện nồng độ NaCl cao (sự xuất hiện các cây bị trắng lá sau 4 ngày chuyển đĩa). Từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 7, số lượng cây chết trắng hồn tồn ở dịng cây chuyển gen tăng lên nhanh hơn so với dòng cây đối chứng (sau 7 ngày, dòng cây chuyển gen chỉ cịn 1 cây sống sót trong khi dịng cây đối chứng còn 3 cây). Điều này được ghi nhận ở cả 3 lần lặp lại thí nghiệm. Như vậy, việc siêu biểu hiện GmMSRA6 trên cây mơ hình A. thaliana nhiều khả năng đã làm gia tăng mức độ nhạy cảm của tế bào ở nồng độ NaCl cao. Kết quả này có sự tương đồng với kết quả thu được trong thử nghiệm trên nấm men, chủng nấm men được siêu biểu hiện
GmMSRA6 nhạy cảm với H2O2 hơn chủng đối chứng. Giải thích cho việc siêu biểu
hiện GmMSRA6 làm tế bào trở nên nhạy cảm với các tác nhân bất lợi từ môi trường, chúng tôi đặt ra giả thuyết về sự cạnh tranh cơ chất giữa các enzyme như sau: Trong điều kiện bất lợi gây ra bởi nồng độ muối cao (NaCl), các Met có thể bị oxi hóa thành MetO, tác động trực tiếp đến chức năng của một số protein và có thể ảnh hưởng đến sức sống của tế bào. Lúc này, các MSRA có hoạt tính xúc tác sẽ tìm kiếm các protein có chứa MetO (cơ chất của MSRA) để sửa chữa sai hỏng. Tuy nhiên, việc siêu biểu hiện gen mã hóa cho GmMSRA6 làm enzyme này được tăng cường tổng hợp ở mức cao trong tế bào, do đó xảy ra sự cạnh tranh cơ chất giữa MSRA6 với các MSRA có hoạt tính sửa chữa. Các MSRA6 bám vào cơ chất, nhưng không xúc tác, trong khi các MSRA khác khơng có điều kiện tương tác được với cơ chất để sửa chữa các Met bị oxi hóa. Như vậy, chức năng của protein khơng được phục hồi làm ảnh hưởng đến sức đề kháng của tế bào trong điều kiện bất lợi, do đó các cây A. thaliana siêu biểu hiện GmMSRA6 trở nên nhạy cảm với nồng độ muối (NaCl) cao hơn so với cây đối chứng.
THẢO LUẬN
Methionine (Met) là axit amin có vai trị thiết yếu với đời sống sinh vật nói chung, là tiền chất của rất nhiều phản ứng chuyển hóa các hợp chất quan trọng trong chu trình sinh trưởng và phát triển của tế bào. Cùng với Cys và Trp, Met nằm trong nhóm các axit amin đặc biệt nhạy cảm với q trình oxi hóa gây ra bởi các tác nhân oxi hóa đặc biệt là sự tấn cơng của các gốc tự do. Q trình oxi hóa Met tạo thành các MetO gây ra sự biến đổi trong cấu trúc của protein, dẫn đến sai hỏng hoặc mất chức năng và protein có thể bị phân hủy. Tế bào sinh vật đã phát triển các cơ chế phức tạp liên quan kiểm soát phản ứng tạo ra các gốc tự do, đáng chú ý là hệ thống các enzyme loại bỏ ROS ở thực vật và các enzyme sửa chữa các hư hỏng do ROS gây ra, enzyme methionine sulfoxide reductase (MSR) nằm trong hệ thống này. Tính từ năm 1981, khi lần đầu tiên MSR được phát hiện và biết đến với vai trò sửa chữa các tổn thương oxi hóa, khử các MetO trong protein về Met đồng thời phục hồi hoạt tính sinh học của protein, cho đến này đã có rất nhiều các nghiên cứu theo hướng khoa học cơ bản về đặc tính, chức năng của các MSR cũng như mở rộng nghiên cứu theo hướng ứng dụng loại enzyme này trên các đối tượng thực vật nhằm tạo ra các giống cây trồng có khả năng chống chịu điều kiện bất lợi của môi trường trong tương lai.
Trong số các thành viên của họ enzyme MSR thì MSRA và MSRB được
nghiên cứu nhiều nhất. Các công bố liên quan đến MSRA khá phong phú, loại enzyme này được nghiên cứu trên nhiều đối tượng sinh vật khác nhau từ vi khuẩn [19], nấm men [29], thực vật [55] đến động vật [48], trong đó có cả con người [38]. Với mục tiêu tìm kiếm một loại gen mới có thể đem lại tính kháng các điều kiện mơi trường bất lợi (khô hạn, xâm nhập mặn, ngập lụt…) cho một số cây lương thực phổ biến, trong nghiên cứu này chúng tơi lựa chọn phân tích đặc tích các MSRA trong hệ gen của đậu tương Glycine max. Trên thế giới, MSRA thực vật đã được
nghiên cứu trên một số loại cây như Arabidopsis thaliana (AtMSRA) [45], lúa gạo
Oryza sativa (OsMSRA) [23], cây bạch dương Populus trichocarpa (PtMSRA) [47],
Gần đây, trong một cơng bố của Le và cs (2013), nhóm nghiên cứu đã phân tích các MSRB trong hệ gen đậu tương (GmMSRB) và nhận thấy sự tồn tại của 5 gen MSRB trong hệ gen của đậu tương bao gồm: GmMSRB1 và 2 cặp gen là các gen lặp lại của nhau bao gồm GmMSRB2 và GmMSRB5, GmMSRB3 và GmMSRB4. Trong đó, GmMRSB1, GmMSRB2 và GmMSRB4 có hoạt tính khử các MetO ở dạng liên kết
trong phân tử protein. Đáng chú ý là GmMSRB2 (Cys121 xúc tác và Cys68 tái tạo) cịn có hoạt tính enzyme đối với các Met-R-O dạng tự do tương tự enzyme fRMSR của vi khuẩn E. coli. Đây được coi là hoạt tính mới đối với nhóm enzyme MSRB ở thực vật. Khi siêu biểu hiện các GmMSRB trên các chủng nấm men đã bị bất hoạt đồng thời cả 3 gen mã hóa các MSR (MSRA/MSRB/fRMSR), ghi nhận GmMSRB2 và GmMSRB4 có khả năng bảo vệ tế bào trong điều kiện oxi hóa gây ra bởi H2O2. Nghiên cứu này chỉ ra rằng: trái ngược với nhóm động vật có vú khơng thể khử Met-R-O dạng tự do, ở thực vật đã phát triển các MSRB có khả năng khử đồng thời MetO dạng tự do và dạng liên kết trong protein tương tự như ở vi khuẩn, phản ánh mức độ đa dạng của các loại protein MSRB ở thực vật [35]. Chúng ta đã biết, Việt Nam là một trong những quốc gia chịu ảnh hưởng nặng nề của biến đổi khí hậu tồn cầu, với nền nơng nghiệp là một lợi thế to lớn, điều kiện ngoại cảnh bất lợi có tác hại rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của thực vật. Việc cải thiện và phát triển các giống cây trồng có khả năng chống chịu cao, sức đề kháng tốt giữ vai trò đặc biệt quan trọng trong việc nâng cao năng suất, chất lượng giống, đảm bảo an ninh lương thực quốc gia và góp phần tích cực trong xuất khẩu. Ở nước ta hiện nay, các cơng bố về tính chống chịu bất lợi môi trường ở thực vật nói chung và cây đậu tương nói riêng thường tập trung vào các gen chịu mặn – Saltol, gen chịu ngập úng – Sub1, gen chịu lạnh – COR, chưa có cơng trình nghiên cứu nào về oxi hóa Met
cũng như vai trị của các enzyme MSR. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tơi từng bước phân tích các đặc tính cũng như chức năng của các MSRA được phân lập