Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH GEN MÃ HĨA ENZYME GmMSRA
3.4.5. Kết quả xác định tỷ lệ đồng hợp/dị hợp của các dòng cây chuyển ge nở
thế hệ F3
Các cây mơ hình A. thaliana chuyển gen GmMSRA6 sau khi được chọn lọc
trên môi trường kháng sinh và kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng phản ứng PCR đã được trồng trên giá thể đất và thu hạt đến thế hệ F3. Hạt chuyển gen F3 được khử trùng (1 lần dung dịch C2H5OH 70%, 2 lần dung dịch NaClO 1% và rửa nước 5 lần) và gieo đồng thời trên môi trường ½ MS có và khơng có kháng sinh kanamycin để xác định tỷ lệ đồng hợp/ dị hợp. Kết quả thí nghiệm được minh họa trong hình 3.21, 3.22 và 3.23. Như vậy, với tỷ lệ nảy mầm đồng đều trên cả 2 môi trường và không xuất hiện cây bị chết trắng sau khi nảy mầm (hình 3.20), qua 3 thế hệ trồng và thu hạt chúng tơi đã có được các dịng cây chuyển gen 35S::GmMSRA6 và dòng cây đối chứng (vector control) đồng hợp tử để sử dụng cho các phân tích tiếp theo. Tuy nhiên sức nảy mầm và phát triển của các hạt trên mỗi đĩa thí nghiệm và mỗi dịng cây có sự khác biệt nhất định, phụ thuộc vào độ lép và mẩy của hạt thu được.
Hình 3.20. Hình thái cây mang gen chuyển (A) và khơng mang gen chuyển (B) ở giai đoạn 10 ngày tuổi
Dịng cây đối chứng (Vector control)
Hình 3.21. Dịng cây đối chứng ở thế hệ F3
Hình A: Cây đối chứng 10 ngày tuổi trên mơi trường ½ MS.
Hình B, C, D: Cây đối chứng 10 ngày tuổi trên mơi trường ½ MS, kanamycin 30
Dịng cây chuyển gen 35S::GmMSRA6-1
Hình 3.22. Dịng cây chuyển gen 35S::GmMSRA6-1 ở thế hệ F3
Hình A: Cây chuyển gen 10 ngày tuổi trên mơi trường ½ MS.
Hình B, C, D: Cây chuyển gen 10 ngày tuổi trên mơi trường ½ MS, kanamycin 30
Dịng cây chuyển gen 35S::GmMSRA6-2
Hình 3.23. Dịng cây chuyển gen 35S::GmMSRA6-2 ở thế hệ F3
Hình A: Cây chuyển gen 10 ngày tuổi trên mơi trường ½ MS.
Hình B, C, D: Cây chuyển gen 10 ngày tuổi trên mơi trường ½ MS, kanamycin 30
3.4.6.1. Hình thái cây trên đĩa thạch
Gieo 2 dịng hạt chuyển gen 35S::GmMSRA6 và hạt đối chứng (Vector control) trên mơi trường ½ MS, bổ sung kanamycin 30 mg/L. Đĩa cây được đặt trong phịng ni ở nhiệt độ 22-24°C, chiếu sáng 16/24 giờ. Quan sát hình thái cây trong đĩa thạch MS ở các giai đoạn 7 và 14 ngày tuổi. Kết quả được minh họa trong hình 3.24
Hình 3.24. Hình thái các dịng cây chuyển gen trên đĩa thạch ở các giai đoạn tuổi khác nhau
Chọn các cây 10 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên mơi trường ½ MS chuyển sang giá thể đất, đặt trong phịng ni ở nhiệt độ 22-24°C, độ ẩm 70-80%, chiếu sáng 16/24 giờ. Sự thay đổi hình thái cây trên giá thể đất được ghi nhận ở giai đoạn 3, 4 và 5 tuần tuổi. Kết quả được minh họa trong hình 3.25.
Hình 3.25. Hình thái các dịng cây chuyển gen trên giá thể đất ở các giai đoạn tuổi khác nhau
Kết quả kiểm tra hình thái cây chuyển gen trên môi trường thạch MS và giá thế đất cho thấy việc siêu biểu hiện gen GmMSRA6 trên cây A. thaliana không làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây.
Gieo 2 dòng hạt chuyển gen 35S::GmMSRA6 và hạt đối chứng (Vector control) trên mơi trường ½ MS, bổ sung kanamycin 30 mg/L. Chọn các cây có kích thước tương đương nhau ở giai đoạn 14 ngày tuổi chuyển sang 2 loại mơi trường: (i) Mơi trường ½ MS, kanamycin 30 mg/L, có bổ sung NaCl ở nồng độ 200 mM: đĩa thử nghiệm NaCl, lặp lại 3 lần. (ii) Mơi trường ½ MS, kanamycin 30 mg/L: đĩa đối chứng. Đếm các cây sống sót trên mơi trường NaCl bắt đầu từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 7.
Hình 3.26. Đĩa cây đối chứng mơi trường ½ MS, kanamycin 30 mg/ L
Số ngày cây trên môi trường đối chứng (½ MS, kanamycin 30 mg/ L) được đánh số từ 2 - 7 trên hình.
Hình 3.27. Thử nghiệm kháng mặn trên dòng cây đối chứng và dòng cây chuyển gen
Số ngày cây trên mơi trường ½ MS, kanamycin 30 mg/ L, NaCl 200 mM được đánh số từ 1 – 8 trên hình.
Kết quả thử nghiệm kháng mặn ở nồng độ NaCl 200 mM (hình 3.26 và hình 3.27) cho thấy cả dòng cây đối chứng (vector trống) và dòng cây chuyển gen
35S::GmMSRA6 (vector mang gen mã hóa GmMSRA6) đều có biểu hiện đáp ứng
nhạy cảm trong điều kiện nồng độ NaCl cao (sự xuất hiện các cây bị trắng lá sau 4 ngày chuyển đĩa). Từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 7, số lượng cây chết trắng hồn tồn ở dịng cây chuyển gen tăng lên nhanh hơn so với dòng cây đối chứng (sau 7 ngày, dòng cây chuyển gen chỉ cịn 1 cây sống sót trong khi dòng cây đối chứng còn 3 cây). Điều này được ghi nhận ở cả 3 lần lặp lại thí nghiệm. Như vậy, việc siêu biểu hiện GmMSRA6 trên cây mơ hình A. thaliana nhiều khả năng đã làm gia tăng mức độ nhạy cảm của tế bào ở nồng độ NaCl cao. Kết quả này có sự tương đồng với kết quả thu được trong thử nghiệm trên nấm men, chủng nấm men được siêu biểu hiện
GmMSRA6 nhạy cảm với H2O2 hơn chủng đối chứng. Giải thích cho việc siêu biểu
hiện GmMSRA6 làm tế bào trở nên nhạy cảm với các tác nhân bất lợi từ môi trường, chúng tôi đặt ra giả thuyết về sự cạnh tranh cơ chất giữa các enzyme như sau: Trong điều kiện bất lợi gây ra bởi nồng độ muối cao (NaCl), các Met có thể bị oxi hóa thành MetO, tác động trực tiếp đến chức năng của một số protein và có thể ảnh hưởng đến sức sống của tế bào. Lúc này, các MSRA có hoạt tính xúc tác sẽ tìm kiếm các protein có chứa MetO (cơ chất của MSRA) để sửa chữa sai hỏng. Tuy nhiên, việc siêu biểu hiện gen mã hóa cho GmMSRA6 làm enzyme này được tăng cường tổng hợp ở mức cao trong tế bào, do đó xảy ra sự cạnh tranh cơ chất giữa MSRA6 với các MSRA có hoạt tính sửa chữa. Các MSRA6 bám vào cơ chất, nhưng không xúc tác, trong khi các MSRA khác khơng có điều kiện tương tác được với cơ chất để sửa chữa các Met bị oxi hóa. Như vậy, chức năng của protein không được phục hồi làm ảnh hưởng đến sức đề kháng của tế bào trong điều kiện bất lợi, do đó các cây A. thaliana siêu biểu hiện GmMSRA6 trở nên nhạy cảm với nồng độ muối (NaCl) cao hơn so với cây đối chứng.
THẢO LUẬN
Methionine (Met) là axit amin có vai trị thiết yếu với đời sống sinh vật nói chung, là tiền chất của rất nhiều phản ứng chuyển hóa các hợp chất quan trọng trong chu trình sinh trưởng và phát triển của tế bào. Cùng với Cys và Trp, Met nằm trong nhóm các axit amin đặc biệt nhạy cảm với q trình oxi hóa gây ra bởi các tác nhân oxi hóa đặc biệt là sự tấn công của các gốc tự do. Q trình oxi hóa Met tạo thành các MetO gây ra sự biến đổi trong cấu trúc của protein, dẫn đến sai hỏng hoặc mất chức năng và protein có thể bị phân hủy. Tế bào sinh vật đã phát triển các cơ chế phức tạp liên quan kiểm soát phản ứng tạo ra các gốc tự do, đáng chú ý là hệ thống các enzyme loại bỏ ROS ở thực vật và các enzyme sửa chữa các hư hỏng do ROS gây ra, enzyme methionine sulfoxide reductase (MSR) nằm trong hệ thống này. Tính từ năm 1981, khi lần đầu tiên MSR được phát hiện và biết đến với vai trò sửa chữa các tổn thương oxi hóa, khử các MetO trong protein về Met đồng thời phục hồi hoạt tính sinh học của protein, cho đến này đã có rất nhiều các nghiên cứu theo hướng khoa học cơ bản về đặc tính, chức năng của các MSR cũng như mở rộng nghiên cứu theo hướng ứng dụng loại enzyme này trên các đối tượng thực vật nhằm tạo ra các giống cây trồng có khả năng chống chịu điều kiện bất lợi của môi trường trong tương lai.
Trong số các thành viên của họ enzyme MSR thì MSRA và MSRB được
nghiên cứu nhiều nhất. Các công bố liên quan đến MSRA khá phong phú, loại enzyme này được nghiên cứu trên nhiều đối tượng sinh vật khác nhau từ vi khuẩn [19], nấm men [29], thực vật [55] đến động vật [48], trong đó có cả con người [38]. Với mục tiêu tìm kiếm một loại gen mới có thể đem lại tính kháng các điều kiện môi trường bất lợi (khô hạn, xâm nhập mặn, ngập lụt…) cho một số cây lương thực phổ biến, trong nghiên cứu này chúng tơi lựa chọn phân tích đặc tích các MSRA trong hệ gen của đậu tương Glycine max. Trên thế giới, MSRA thực vật đã được
nghiên cứu trên một số loại cây như Arabidopsis thaliana (AtMSRA) [45], lúa gạo
Oryza sativa (OsMSRA) [23], cây bạch dương Populus trichocarpa (PtMSRA) [47],
Gần đây, trong một công bố của Le và cs (2013), nhóm nghiên cứu đã phân tích các MSRB trong hệ gen đậu tương (GmMSRB) và nhận thấy sự tồn tại của 5 gen MSRB trong hệ gen của đậu tương bao gồm: GmMSRB1 và 2 cặp gen là các gen lặp lại của nhau bao gồm GmMSRB2 và GmMSRB5, GmMSRB3 và GmMSRB4. Trong đó, GmMRSB1, GmMSRB2 và GmMSRB4 có hoạt tính khử các MetO ở dạng liên kết
trong phân tử protein. Đáng chú ý là GmMSRB2 (Cys121 xúc tác và Cys68 tái tạo) cịn có hoạt tính enzyme đối với các Met-R-O dạng tự do tương tự enzyme fRMSR của vi khuẩn E. coli. Đây được coi là hoạt tính mới đối với nhóm enzyme MSRB ở thực vật. Khi siêu biểu hiện các GmMSRB trên các chủng nấm men đã bị bất hoạt đồng thời cả 3 gen mã hóa các MSR (MSRA/MSRB/fRMSR), ghi nhận GmMSRB2 và GmMSRB4 có khả năng bảo vệ tế bào trong điều kiện oxi hóa gây ra bởi H2O2. Nghiên cứu này chỉ ra rằng: trái ngược với nhóm động vật có vú khơng thể khử Met-R-O dạng tự do, ở thực vật đã phát triển các MSRB có khả năng khử đồng thời MetO dạng tự do và dạng liên kết trong protein tương tự như ở vi khuẩn, phản ánh mức độ đa dạng của các loại protein MSRB ở thực vật [35]. Chúng ta đã biết, Việt Nam là một trong những quốc gia chịu ảnh hưởng nặng nề của biến đổi khí hậu tồn cầu, với nền nông nghiệp là một lợi thế to lớn, điều kiện ngoại cảnh bất lợi có tác hại rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của thực vật. Việc cải thiện và phát triển các giống cây trồng có khả năng chống chịu cao, sức đề kháng tốt giữ vai trò đặc biệt quan trọng trong việc nâng cao năng suất, chất lượng giống, đảm bảo an ninh lương thực quốc gia và góp phần tích cực trong xuất khẩu. Ở nước ta hiện nay, các cơng bố về tính chống chịu bất lợi môi trường ở thực vật nói chung và cây đậu tương nói riêng thường tập trung vào các gen chịu mặn – Saltol, gen chịu ngập úng – Sub1, gen chịu lạnh – COR, chưa có cơng trình nghiên cứu nào về oxi hóa Met
cũng như vai trò của các enzyme MSR. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi từng bước phân tích các đặc tính cũng như chức năng của các MSRA được phân lập từ hệ gen đậu tương, từ đó đưa ra nhận định về vai trị của các MSRA trong việc đáp ứng với điều kiện môi trường bất lợi, tạo tiền đề phát triển một số giống cây trồng nông nghiệp mới trong tương lai.
Sử dụng cơng cụ phân tích tin sinh học, chúng tôi xác định được 7 gen mã hóa cho MSRA trong hệ gen đậu tương bao gồm GmMSRA3 và ba cặp gen là gen
lặp lại của nhau (các gen được hình thành do hiện tượng nhân đôi hệ gen)
GmMSRA1 và GmMSRA6, GmMSRA2 và GmMSRA5, GmMSRA4 và GmMSRA7.
Các GmMSRA đều chứa domain đặc trưng cho protein MSRA, cấu trúc gen đều có sự xen kẽ giữa các đoạn exon và intron. Các protein GmMSRA đều được sinh tổng hợp trong tế bào chất và có thể được vận chuyển đến một vị trí nào đó trong tế bào để thực hiện chức năng. Tuy nhiên, chúng tôi chỉ ghi nhận GmMSRA2 và GmMSRA5 khả năng cao được tiết ra lục lạp và có thực hiện chức năng xúc tác. Trong trình tự chuỗi peptide mã hóa cho các GmMSRA, chúng tơi dự đốn có 5/7 GmMSRA có chứa các Cys liên quan đến hoạt tính enzyme (Cys xúc tác và Cys tái
tạo), riêng với GmMSRA1 và GmMSRA6 tại các vị trí này Cys xúc tác được thay thế bằng Ser, Cys tái tạo được thay thế bằng các axit amin khác, nhiều khả năng 2 enzyme này khơng có hoạt tính khử MetO. Dựa trên một số cơ sở dữ liệu có sẵn (Libault và cs [37], Genevestigator®) chúng tôi đánh giá mức độ biểu hiện của các
GmMSRA trong các mô cơ quan khác nhau cũng như trong điều kiện sinh trưởng
bình thường và bất lợi. Kết quả phân tích cho thấy: GmMSRA3 có mức độ biểu hiện cao nhất ở các mô phân lập từ bộ phận rễ cây (tế bào lông hút, đầu mút, nốt sần), tương tự ở lá cây là GmMSRA2 và GmMSRA5, các GmMSRA cịn lại có tương đồng về mức độ biểu hiện dù được phân lập từ các mơ khác nhau (Hình 3.4). Trong tồn bộ chu trình phát triển bình thường của cây, mức độ biểu hiện của GmMSRA1 và
GmMSRA3 ln được duy trì ở mức cao, đáng chú ý là vai trị của GmMSRA6 được
tăng cường nhanh chóng và duy trì ở mức cao khi cây bước vào thời kì tăng trưởng mạnh (Hình 3.5). Các gen GmMSRA2, GmMSRA4, GmMSRA5 và GmMSRA7 có
khả năng gia tăng sức đề kháng trên lá của đậu tương trong điều kiện bất lợi (khơ hạn) (Hình 3.6). Như vây, tùy thuộc vào loại mô, thời gian và điều kiện sinh trưởng mà mức độ phiên mã của mỗi một GmMSRA sẽ có sự thay đổi nhất định để đáp ứng với yêu cầu của tế bào.
Để nghiên cứu chức năng của MSRA, chúng tôi lựa chọn tách dòng một số
GmMSRA (A3 và A6) để siêu biểu hiện các gen này trên chủng nấm men đã bị bất
hoạt đồng thời cả 3 gen mã hóa các MSR (MSRA/MSRB/fRMSR). Kết quả thu được trong thử nghiệm khả năng xúc tác phản ứng khử MetO về Met chứng minh
GmMSRA3 có hoạt tính xúc tác trong khi GmMSRA6 khơng có hoạt tính này. Điều
này phù hợp với những tính tốn bằng tin sinh học chúng tơi trình bày ở trên, trình tự chuỗi polipeptide mã hóa cho GmMSRA6 thiếu Cys thường thấy nằm trong trung tâm hoạt động của các MSRA (Hình 3.1). Tiếp tục thử nghiệm các dịng tế bào nấm men này trong điều kiện có tác nhân gây oxi hóa H2O2 thì việc siêu biểu hiện
GmMSRA6 làm tế bào nhạy cảm với H2O2 hơn, trong khi đó GmMSRA3 có khả
năng duy trì khả năng sinh trưởng của tế bào tốt hơn.
Để có thêm các dữ liệu thực nghiệm cho việc đánh giá vai trò của các
GmMSRA đối với thực vật, chúng tôi tiếp tục tách dòng và siêu biểu hiện GmMSRA6 trên cây mơ hình Arabidopsis thaliana. Việc siêu biểu hiện gen này
không làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của cây trong điều kiện bình thường nhưng lại gia tăng mức độ nhạy cảm trong điều kiện nồng độ muối cao (NaCl). Như vậy, trên cả hai mơ hình sinh vật biểu hiện là nấm men và cây A. thaliana ghi nhận các kết quả tương tự nhau. Chúng tôi đặt ra giả thuyết về sự cạnh
tranh cơ chất giữa các enzyme để giải thích cho kết quả này như sau: Khi được siêu biểu hiện, GmMSRA6 được tăng cường tổng hợp ở mức cao trong tế bào. Trong
điều kiện bất lợi (có tác nhân oxi hóa H2O2, nồng độ muối cao) tương tác giữa enzyme GmMSRA6 với cơ chất (các phân tử protein có Met bị oxi hóa thành MetO) xảy ra 2 hướng sau:
− Ở cây A. thaliana: xảy ra sự cạnh tranh cơ chất giữa MSRA6 với các MSRA có
hoạt tính sửa chữa. Do hàm lượng sinh tổng hợp trong tế bào cao hơn các MSRA khác, MSRA6 có “cơ hội” cao hơn bám vào cơ chất, nhưng lại khơng có hoạt tính xúc tác, trong khi các MSRA khác khơng có điều kiện tương tác với cơ chất để sửa chữa các Met bị oxi hóa.
− Ở nấm men: trong trường hợp này tất cả các MSR đã bị bất hoạt, MSRA6 tương
tác với cơ chất nhưng do khơng có hoạt tính sửa chữa nên việc MSRA6 bám trên các protein lại trở thành yếu tố kìm hãm hoạt động của các protein (các protein này vẫn có thể thực hiện một phần chức năng sinh học dù có chứa Met bị oxi hóa).
Trong cả 2 thử nghiệm, siêu biểu hiện gen GmMSRA6 hoặc kìm hãm hoạt