Chƣơng 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.6. Vector biểu hiện pET32a
Vector pET32a là một vector thuộc hệ vector pET của hãng Novagen. Đây là vector được thiết kế với mục đích để chọn dịng và biểu hiện ở mức độ cao của các gen ngoại lai ở vi khuẩn E. coli. Vector pET32a (5.900 bp) thường được sử dụng
với mục đích chính là biểu hiện gen. Ưu điểm quan trọng nhất của vector này nằm ở chỗ, các gen đích ngoại lại được chèn vào vector sẽ được dung hợp với protein thioredoxin (Trx.TagTM) có sẵn trên vector [41]. Việc dung hợp giữa protein ngoại
lai với thioredoxin có ý nghĩa rất quan trọng trong việc tạo thành một dạng protein dung hợp có khả năng tan cao hơn. Điều này góp phần giải quyết được vấn để thường gặp phải khi chúng ta biểu hiện các gen đích khơng có nguồn gốc từ vi khuẩn. Khi chúng ta biểu hiện gen ở vi khuẩn thường hay xảy ra trường hợp các protein sau khi được biểu hiện sẽ tồn tại ở dạng khơng tan và sẽ khơng có ý nghĩa trong việc ứng dụng của các protein tái tổ hợp này.
Việc dung hợp của protein thioredoxin với polypeptide khơng chỉ làm tăng tính tan của các protein đích mà cịn có thể xúc tác sự hình thành các liên kết disulfide trong tế bào chất của dạng đột biến TrxB [41].
Vector pET32a sử dụng promoter T7 (có nguồn gốc từ thực khuẩn thể T7) đề điều khiển quá trình phiên mã gen ngoại lai. Đây là một promoter hoạt động rất mạnh trong tế bào E. coli và có tính đặc hiệu cao. Q trình phiên mã được điều hịa bởi protein lacI – sản phẩm của gen lacI.
Trên vector pET32a có gen lacI cho phép điều hịa q trình phiên mã ngay cả khi chủng E. coi thiếu gen lacI nội sinh.
Vùng đa điểm nối bao gồm các trình tự nhận biết của các enzyme hạn chế thông thường, giúp cho quá trình đưa đoạn gen ngoại lai vào vector biểu hiện trở nên dễ dàng.
Tâm tái bản DNA từ thực khuẩn thể M13 cho phép sự tạo thành DNA sợi đơn sử dụng thực khuẩn thể hỗ trợ (M13K07 Helper Phage).
Vector pET32a mang gen chọn lọc AmpR (gen bla) truyền tính kháng Ampicilin sang tế bào chủ, tạo thuận lợi cho việc nhận biết dịng tế bào mang plasmid.
Hình 14. Cấu trúc vector biểu hiện pET32a
(Theo hãng Novagen).
Việc phát hiện và tinh chế protein đích dễ dàng nhờ các trình tự mã hóa cho His*Tag và S*Tag. Những trình tự này dễ dàng loại bỏ khỏi protein đích.
Như vậy, hệ vector pET32a không những thuận lợi cho việc biểu hiện mà còn thuận lợi cho quá trình tinh sạch protein ngoại lai.