Chƣơng 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Thiết kế vector biểu hiện FIX (pET32a/FIXnoSP)
3.2.1. Khuếch đại cDNA mã hóa FIXnoSP
Trong nghiên cứu này, vector pJET1.2/FIX_p19 đã được sử dụng làm khuôn để nhân bản gen cần biểu hiện. Trên cơ sở trình tự mRNA mã hóa FIX của người cơng bố trên Ngân hàng trình tự gen Quốc tế GenBank (NM_000133), chúng tôi đã thiết kế cặp mồi nhân cDNA mã hóa FIXnoSP như sau:
FIX-F4-NcoI
5’-TTC TGG TGC ACC ATG GTT TTT CTT GAT CAT GAA AAC NcoI
GCC-3’ FIX-R5-XhoI
5’- ATATG CTCGAG TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG AGT XhoI
GAG CTT TGT TTT TTC C- 3’
Cặp mồi đã được chúng tơi thiết kế mang các trình tự nhận biết của enzyme hạn chế để sử dụng cho các quá trình ghép nối gen và kiểm tra sản phẩm. Việc thiết kế thêm trình tự nhận biết của các enzyme hạn chế vào mồi tuân theo một số ngun tắc như trình tự nhận biết chỉ có một vị trí trong vùng đa điểm cắt của vector và khơng có mặt trong gen cần tạo dịng. Số nucleotide phía ngồi trình tự nhận biết từ 3- 6 nucleotide nhằm bảo vệ các trình tự này và giúp các enzyme cắt tốt hơn. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hai enzyme là NcoI và XhoI, vì chúng có
mặt trong vùng cắt gắn đa điểm của vector biểu hiện pET32a. Các enzyme này đều khơng có điểm cắt trên cDNA mã hố FIXnoSP.
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu, chúng tôi đã tiến hành phản ứng nhân cDNA mã hóa FIXnoSP. Thành phần và chu trình nhiệt được trình bày ở phần (2.2.3). Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di được thể hiện ở Hình 24.
Kết quả điện di đồ cho thấy, sản phẩm PCR thu được có kích thước phân tử khoảng 1,3 kb, kích thước này phù hợp với kích thước tính tốn lý thuyết. Băng sản phẩm PCR sáng, đậm và rõ nét đủ điều kiện cho việc tạo dòng vector tái tổ hợp. Sản phẩm PCR này được xử lý với enzyme hạn chế NcoI và XhoI, sau đó tinh sạch trước khi sử dụng để tiến hành ghép nối gen.
Hình 24. Ảnh điện di đồ sản phẩm PCR nhân cDNA mã hóa FIXnoSP.
M: Marker 1 kb (Fermentas); 1 : Sản phẩm PCR của cDNA mã hóa FIXnoSP nhân từ khuôn là pJET1.2/FIX (p19).