Chƣơng 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Biểu hiện cDNA mã hóa FIXnoSP ở vi khuẩn E.coli BL21(DE3)
Trong nghiên cứu này, sau khi thu được các dòng plasmid mang cDNA mã hoá FIXnoSP, để biểu hiện trong vi khuẩn E. coli, chúng tôi đã tiến hành biến nạp hai vector tái tổ hợp (pET32a và pET32a/FIXnoSP mang gen mã hoá FIXnoSP)vào tế bào vi khuẩn E. coli chủng BL21(DE3) theo phương pháp sốc nhiệt. Các chủng vi
khuẩn E. coli BL21(DE3) chứa tổ hợp gen mới pET32a/FIXnoSP và vector pET32a được nuôi cấy trên môi trường LB đặc. Sau đó, được chuyển sang mơi trường LB lỏng đều được bổ sung Amp đến nồng độ cuối cùng là 100 µg/ml. Dịch tế bào sau khi cấy chuyển với tỷ lệ 1%, nuôi lắc ở 37o
C khi OD600 đạt từ 0,6 – 0,8 được cảm ứng bởi IPTG đến nồng độ cuối cùng 0,5 mM. Thu sinh khối tế bào ở các thời điểm 0h, 1h và 3h sau khi cảm ứng. Kết thúc thí nghiệm, chúng tơi thu được dịch tế bào có chứa protein tái tổ hợp. Để kiểm tra kết quả biểu hiện chúng tơi đã tiến hành điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide 12,6% có SDS. Kết quả điện di protein tổng số của các mẫu được trình bày ở Hình 29.
Kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp cho thấy, protein tổng số của các mẫu tế bào ở phân đoạn không tan thu tại các thời điểm khác nhau sau khi được cảm ứng bằng IPTG (các đường chạy từ 4 - 6), có xuất hiện một băng protein mới có khối lượng phân tử khoảng 67 kDa so với mẫu đối chứng sau khi cảm ứng bởi IPTG (các đường chạy từ 1 - 3). Như đã trình bày ở trên, ở đây sản phẩm protein lai FIXnoSP- Trx biểu hiện sẽ bao gồm trình tự đoạn lai (158 aa) và trình tự FIXnoSP (433 aa), tương đương với băng có kích thước khoảng 67 kDa. Như vậy protein mới này có
trọng lượng phân tử phù hợp với tính tốn lý thuyết về trọng lượng phân tử của protein FIXnoSP-Trx.
Hình 29. Điện di kết quả biểu hiện protein trên gel polyacrylamide 12,6%.
M: Marker protein (Fermentas); 1: Protein tổng số của đối chứng (pET32a), tại thời điểm 0h (trước cảm ứng); 2-3: Protein tổng số của đối chứng (pET32a), sau 1h và 3h cảm ứng bằng IPTG; 4-6: Protein tổng số của mẫu tế bào E.coli mang pET32a/FIXnoSP ở pha không tan sau 0h, 1h và 3h cảm ứng bằng IPTG.
Kết quả điện di trên gel acrylamide 12,6% cho thấy protein dung hợp FIXnoSP-Trx được biểu hiện tốt nhất ở nhiệt độ 37oC, 0,5 mM IPTG và thời gian nuôi cấy là 3h sau cảm ứng (Hình 29). Các kết quả nhận được cho thấy các điều kiện đã sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp là tương đối phù hợp.
Năm 1987, Lin và cộng sự đã biểu hiện FIX trong E. coli ở dạng cả đoạn
cDNA mã hóa FIX và 13 đoạn nhỏ khác nhau [44]. Các protein tái tổ hợp được biểu hiện dưới dạng protein dung hợp với trình tự mã hóa protein vỏ của T7 ở sau codon 326. Tất cả các protein dung hợp được biểu hiện thành công nhưng đều ở dạng thể vùi. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã ứng dụng mơ hình của nhóm Lin và để thiết kế vector mang cDNA mã hóa FIXnoSP. Protein tái tổ hợp được thiết kế trong vector pET32a dưới dạng dung hợp với Trx. Khác với nhóm Lin, đoạn tín hiệu tiết gồm 28 amino acid đã được cắt khỏi protein FIX tạo nên protein hoàn chỉnh. pET32a là một vector biểu hiện mạnh trong tế bào chất của E. coli, do đó đã tạo ra
Hầu hết các protein ở dạng thể vùi đều khơng cịn hoạt tính, đặc biệt là các enzyme, vì vậy nhiều phương pháp đã được phát triển để đưa protein ở dạng thể vùi về dạng có cấu trúc như cấu trúc tự nhiên của chúng. Quá trình này được gọi là quá trình tái cấu trúc (refolding), mặc dù vậy khơng có một công thức chung nào áp dụng cho mọi protein.
Năm 2005, Singh và cộng sự đã thành cơng trong việc biểu hiện gen mã hóa hormone sinh trưởng của người (human growth hormone) ở vi khuẩn E.coli [53].
Tuy vậy, protein tái tổ hợp được tổng hợp ở vi khuẩn E. coli cũng tồn tại ở dạng thể vùi. Để thu được protein tái tổ hợp dạng có hoạt tính sinh học, nhóm nghiên cứu của Singh đã tiến hành phân lập protein thể vùi bằng ly tâm. Tiếp đó, các protein thể vùi được hòa tan trong dung dịch đệm biến tính. Dạng protein biến tính phải được tái cấu trúc xoắn cuộn để khôi phục cấu trúc tự nhiên. Kết quả, nhóm nghiên cứu của Singh đã tạo ra được protein tái tổ hợp dạng hịa tan, có hoạt tính sinh học từ dạng thể vùi ban đầu.
Ở Việt Nam, trong những năm gần đây đã có rất nhiều nghiên cứu biểu hiện gen ở trên đối tượng tế bào chủ là vi khuẩn E. coli, cũng đã gặp phải vấn đề, protein tái tổ hợp khi được biểu hiện ở dạng thể vùi. Điều này đang là một vấn đề trở ngại lớn cho hướng nghiên cứu biểu hiện gen ở vi khuẩn E. coli. Tuy nhiên, một công bố gần đây của Thạc sĩ Lê Thu Ngọc (2009) đã thành công trong việc biến đổi từ protein tái tổ hợp dạng thể vùi sau khi biểu hiện ở vi khuẩn E. coli thành protein
dạng hịa tan, có hoạt tính sinh học giống như dạng protein tự nhiên [5]. Kết quả này có ý nghĩa đóng góp giải quyết được những khó khăn gặp phải khi biểu hiện gen ở vi khuẩn E. coli.
Từ những kết quả nghiên cứu của các nhóm nghiên cứu trên, kết quả biểu hiện gen mã hóa yếu tố đơng máu IX của người ở vi khuẩn E. coli của chúng tơi có thể được xem đây là một bước tiền đề quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo, để tạo ra được chế phẩm điều trị bệnh Hemophilia ở Việt Nam trong tương lai.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
Từ những kết quả thu được ở trên, chúng tơi có một số kết luận sau:
Từ mô gan sinh thiết của người Việt Nam khỏe mạnh, chúng tơi đã tách được RNA tổng số có chất lượng đảm bảo, làm nguyên liệu tổng hợp cDNA mã hóa cho FIX.
Đã nhân được đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đơng máu ở người (FIX). Đoạn cDNA mã hóa FIX có độ dài tương ứng khoảng 1,4 kb mã hóa 461 amino acid đã được tách dịng và giải trình tự.
Đã thiết kế được vector biểu hiện pET32a/FIXnoSP mang đoạn cDNA mã hóa
FIXnoSP và biểu hiện được gen mã hóa cho yếu tố đơng máu IX ở E. coli.
Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu biểu hiện cDNA mã hóa FIXnoSP trong vector pET32a ở vi khuẩn E.coli.
Nghiên cứu phương pháp biến tính, hồi tính cho protein dung hợp FIXnoSP- Trx thể vùi để thu được protein FIXnoSP ở dạng tan. Từ đó, nghiên cứu phương pháp tinh sạch protein FIXnoSP để từng bước tiến tới sản xuất chế phẩm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
1. Bùi Thị Huyền, Đặng Thành Nam, Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Hồng Quốc Trường, Phan Văn Chi (2005), “Biểu hiện và xác định interleukin-2 của người”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 3(2), tr. 143-148.
2. Chu Kỳ Nam, Hoàng Văn Quốc Chương, Trần Linh Thước (2005), “Tạo dòng và biểu hiện mini-proinsulin của người tái tổ hợp trong Escherichia coli”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 3(2), tr. 155-160.
3. Đặng Trần Hoàng, Vũ Minh Đức, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải (2005), “Biểu hiện gen interleukin-2 của người rh-IL2MM bị đột biến tại các điểm
glycosyl hóa và gốc cysteine 125 trong Escherichia coli”, Tạp chí Cơng nghệ
Sinh học. 3(2), tr. 149-154.
4. Lã Thị Huyền, Nguyễn Phương Hoa, Đặng Thị Thu, Lê Quang Huấn (2009), “Biểu hiện kháng nguyên CD25 tái tổ hợp trong vi khuẩn E.coli”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 7(3), tr. 319-324.
5. Lê Thu Ngọc (2009), “Tổng hợp và biểu hiện gen mã hóa cho enterocin P của vi khuẩn Enterococcus faecium P13 trong tế bào Escherichia coli ER2566”, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
6. Lê Trần Bình, Cao Huyền Trang (2005), “Nghiên cứu và phát triển sản xuất vaccine ăn được trong thực vật”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 3(2), tr. 133- 142.
7. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nơng Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003), Áp dụng các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật
Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
8. Nguyễn Đình Cường, Lê Thị Thu Hiền, Nơng Văn Hải, Đặng Thành Nam, Phan Văn Chi (2004), “Tinh chế và phân tích khối phổ protein bất hoạt ribosome
tái tổ hợp từ cây mướp đắng (Momordica charantia L.)”, Tạp chí Cơng nghệ
Sinh học, 2(2), tr. 217-226.
9. Nguyễn Đình Cường, Nguyễn Thùy Dương, Lê Thị Thu Hiền, Lương Thị Thu Hường, Trần Thị Phương Liên, Nguyễn Huy Hoàng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải (2003), “Biểu hiện gen mã hóa protein bất hoạt ribosome của cây mướp đắng ở vi khuẩn Escherichia coli”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 1(4), tr. 451-460.
10. Nguyễn Đình Huyên (1998), Sinh học phân tử ADN, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
11. Nguyễn Hải Hà, Nguyễn Văn Phòng, Nguyễn Đăng Tơn, Nguyễn Huy Hồng, Quyền Đình Thi, Nơng Văn Hải (2010), “Biểu hiện yếu tố hoạt hóa plasminogen mơ (h-tPA) người ở tế bào”, Kỷ yếu hội nghị sinh học phân và
hóa sinh y học, tr. 185-191.
12. Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2005), “Tách dịng gen mã hóa interleukin-2 của người”, Y học Việt Nam 310(5), tr. 26-30.
13. Nguyễn Thu Thúy, Trần Vân Khánh, Phạm Đăng Khoa, Tạ Thành Văn (2008), “Nghiên cứu tách dịng gen mã hóa yếu tố đơng máu VIII ở người”, Tạp chí
nghiên cứu Y học, tr. 7-12.
14. Nguyễn Thúy Hà, Nguyễn Bích Nhi, Đỗ Khắc Hiếu, Phan Văn Chi (2003), “Khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro của Trichobakin tái tổ hợp”, Y học Việt Nam, 284, tr. 26-30.
15. Vũ Ngọc Tân, Vũ Minh Đức, Lê Thị Lan Anh, Bùi Khánh Chi, Trương Nam Hải (2009), “Biểu hiện gen mã hóa interleukin-2 của người trong tế bào
Escherichia coli”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 7(1), tr. 35-39.
Tài liệu tiếng anh
17. Anson D. S., Choo K. H., Rees D. J., Giannelli F., Gould K., Huddleston J. A., Brownlee G. G. (1984), "The gene structure of human anti-haemophilic factor IX", EMBO J, 3(5), pp. 1053-1060.
18. Bajaj S. P., Sabharwal A. K., Gorka J., Birktoft J. J. (1992), "Antibody-probed conformational transitions in the protease domain of human factor IX upon calcium binding and zymogen activation: putative high-affinity Ca2+-binding site in the protease domain", Proc Natl Acad Sci U S A, 89(1), pp. 152-156. 19. Bovill E. G., Mann K. G. (1987), "Warfarin and the biochemistry of the vitamin
K dependent proteins", Adv Exp Med Biol, 214, pp. 17-46.
20. Brandstetter H., Bauer M., Huber R., Lollar P., Bode W. (1995), "X-ray structure of clotting factor IXa: active site and module structure related to Xase activity and hemophilia B", Proc Natl Acad Sci U S A, 92(21), pp.
9796-9800.
21. Bristol J. A., Freedman S. J., Furie B. C., Furie B. (1994), "Profactor IX: the propeptide inhibits binding to membrane surfaces and activation by factor XIa", Biochemistry, 33(47), pp. 14136-14143.
22. Broze G. J., Jr., Gailani D. (1993), "The role of factor XI in coagulation",
Thromb Haemost, 70(1), pp. 72-74.
23. Chalmers E. A. (2004), "Haemophilia and the newborn", Blood Rev, 18(2), pp.
85-92.
24. Chavin S. I., Weidner S. M. (1984), "Blood clotting factor IX. Loss of activity after cleavage of sialic acid residues", J Biol Chem, 259(6), pp. 3387-3390. 25. Chen S. H., Yoshitake S., Chance P. F., Bray G. L., Thompson A. R., Scott C.
R., Kurachi K. (1985), "An intragenic deletion of the factor IX gene in a family with hemophilia B", J Clin Invest, 76(6), pp. 2161-2164.
26. Derian C. K., VanDusen W., Przysiecki C. T., Walsh P. N., Berkner K. L., Kaufman R. J., Friedman P. A. (1989), "Inhibitors of 2-ketoglutarate- dependent dioxygenases block aspartyl beta-hydroxylation of recombinant
human factor IX in several mammalian expression systems", J Biol Chem,
264(12), pp. 6615-6618.
27. Di Scipio R. G., Kurachi K., Davie E. W. (1978), "Activation of human factor IX (Christmas factor)", J Clin Invest, 61(6), pp. 1528-1538.
28. Doolittle R. F., Feng D. F., Johnson M. S. (1984), "Computer-based characterization of epidermal growth factor precursor", Nature, 307(5951),
pp. 558-560.
29. Fernlund P., Stenflo J. (1983), "Beta-hydroxyaspartic acid in vitamin K- dependent proteins", J Biol Chem, 258(20), pp. 12509-12512.
30. Furie B., Bouchard B. A., Furie B. C. (1999), "Vitamin K-dependent biosynthesis of gamma-carboxyglutamic acid", Blood, 93(6), pp. 1798-1808. 31. Furie B., Furie B. C. (1988), "The molecular basis of blood coagulation", Cell,
53(4), pp. 505-518.
32. Furie B., Furie B. C. (2005), "Thrombus formation in vivo", J Clin Invest,
115(12), pp. 3355-3362.
33. Galeffi P., Brownlee G. G. (1987), "The propeptide region of clotting factor IX is a signal for a vitamin K dependent carboxylase: evidence from protein engineering of amino acid -4", Nucleic Acids Res, 15(22), pp. 9505-9513. 34. Green P. M., Bentley D. R., Mibashan R. S., Nilsson I. M., Giannelli F. (1989),
"Molecular pathology of haemophilia B", EMBO J, 8(4), pp. 1067-1072. 35. Hoag H., Gore J., Barry D., Mueller C. (1999), "Gene therapy expression
vectors based on the clotting Factor IX promoter", Gene Ther, 6(9), pp.
1584-1589.
36. Hoffman M., Monroe D. M., 3rd (2001), "A cell-based model of hemostasis",
Thromb Haemost, 85(6), pp. 958-965.
37. Hoffman M., Monroe D. M., Oliver J. A., Roberts H. R. (1995), "Factors IXa and Xa play distinct roles in tissue factor-dependent initiation of coagulation", Blood, 86(5), pp. 1794-1801.
38. Kaufman R. J. (1998), "Post-translational modifications required for coagulation factor secretion and function", Thromb Haemost, 79(6), pp. 1068-1079. 39. Kurachi K., Davie E. W. (1982), "Isolation and characterization of a cDNA
coding for human factor IX", Proc Natl Acad Sci U S A, 79(21), pp. 6461-
6464.
40. Laemmli U. K. (1970), "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature, 227(5259), pp. 680-685.
41. LaVallie E. R., DiBlasio E. A., Kovacic S., Grant K. L., Schendel P. F., McCoy J. M. (1993), "A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm", Biotechnology (N Y),
11(2), pp. 187-193.
42. Lawson J. H., Mann K. G. (1991), "Cooperative activation of human factor IX by the human extrinsic pathway of blood coagulation", J Biol Chem,
266(17), pp. 11317-11327.
43. Lenting P. J., Christophe O. D., Maat H., Rees D. J., Mertens K. (1996), "Ca2+ binding to the first epidermal growth factor-like domain of human blood coagulation factor IX promotes enzyme activity and factor VIII light chain binding", J Biol Chem, 271(41), pp. 25332-25337.
44. Lin S. W., Dunn J. J., Studier F. W., Stafford D. W. (1987), "Expression of human factor IX and its subfragments in Escherichia coli and generation of antibodies to the subfragments", Biochemistry, 26(17), pp. 5267-5274.
45. Lindquist P. A., Fujikawa K., Davie E. W. (1978), "Activation of bovine factor IX (Christmas factor) by factor XIa (activated plasma thromboplastin antecedent) and a protease from Russell's viper venom", J Biol Chem,
253(6), pp. 1902-1909.
46. Mannucci P. M., Ruggeri Z. M., Pareti F. I., Capitanio A. (1977), "1-Deamino- 8-d-arginine vasopressin: a new pharmacological approach to the management of haemophilia and von Willebrands' diseases", Lancet,
47. Nemerson Y. (1992), "The tissue factor pathway of blood coagulation", Semin Hematol, 29(3), pp. 170-176.
48. Park C. H., Seo J. Y., Kim H. J., Jang J. H., Kim S. H. "A diagnostic challenge: mild hemophilia B with normal activated partial thromboplastin time", Blood
Coagul Fibrinolysis, 21(4), pp. 368-371.
49. pET system manual of Novagen (2003), 10th Edition Rev.B0403, pp. 11-13. 50. Presnell S. R., Stafford D. W. (2002), "The vitamin K-dependent carboxylase",
Thromb Haemost, 87(6), pp. 937-946.
51. Sambrook J., Russel W. D. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
3rd, ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 52. Siguret V., Amselem S., Vidaud M., Assouline Z., Kerbiriou-Nabias D., Pietu
G., Goossens M., Larrieu M. J., Bahnak B., Meyer D., et al. (1988), "Identification of a CpG mutation in the coagulation factor-IX gene by analysis of amplified DNA sequences", Br J Haematol, 70(4), pp. 411-416. 53. Singh S. M., Panda A. K. (2005), "Solubilization and refolding of bacterial
inclusion body proteins", J Biosci Bioeng, 99(4), pp. 303-310.
54. Sona P.S, Lingam C. M. (2010). "Hemophilia: An overview", International journal of pharma ceutical review and rechear, 5, pp. 18-26.
55. Stenina O., Pudota B. N., McNally B. A., Hommema E. L., Berkner K. L.