Chƣơng 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Sơ đồ thí nghiệm
Nội dung nghiên cứu được chia làm hai phần và thực hiện qua các bước sau:
a. Phân lập gen mã hóa yếu tố đơng máu IX từ mơ gan sinh thiết ở người
Tách chiết RNA tổng số từ mô gan sinh thiết của người bằng trizol.
Tổng hợp cDNA từ RNA tổng số nhờ việc sử dụng mồi Oligo (dT) và enzyme phiên mã ngược SuperScriptTM
II Reverse Transcriptase (RT).
Khuếch đại tồn bộ cDNA mã hóa FIX bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu (F1/R1) đã được thiết kế dựa trên trình tự có sẵn của gen FIX trên ngân hàng
gen quốc tế GenBank (mã số NM_000133).
Ghép nối cDNA mã hóa FIX với vector tách dịng pJET1.2 tạo plasmid tái tổ hợp, kí hiệu là pJET1.2/FIX và biến nạp sản phẩm ghép nối này và tế bào khả biến
E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt.
Kiểm tra cDNA mã hóa FIX trong vector tách dịng bằng enzyme hạn chế và giải trình tự.
b. Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa FIXnoSP và biểu hiện trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21(DE3)
Nhân đoạn cDNA mã hóa FIX với chuỗi polypeptide cắt tín hiệu tiết đầu N, (kí hiệu là FIXnoSP) từ khuôn là plasmid tái tổ hợp pJET1.2/FIX bằng cặp mồi đặc
hiệu (F4/R5).
Cắt sản phẩm PCR bằng các enzyme hạn chế, đồng thời cắt vector pET32a bằng các enzyme hạn chế tương ứng.
Ghép nối đoạn cDNA mã hóa FIXnoSP vào vector biểu hiện pET32a tạo plasmid tái tổ hợp pET32a/ FIXnoSP và biến nạp vào chủng biểu hiện E. coli DH5α
bằng phương pháp sốc nhiệt. Theo cách thiết kế này, FIXnoSP sẽ được biểu hiện ở dạng dung hợp với TrxA.
Biến nạp các vector tái tổ hợp (pET32a và pET32a/ FIXnoSP) vào chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt.
Cảm ứng biểu hiện protein dung hợp.
Kiểm tra protein dung hợp bằng phương pháp điện di SDS-PAGE.
Quy trình phân lập và biểu hiện gen mã hóa yếu tố đơng máu IX trong tế bào
E.coli BL21(DE3) được tóm tắt ở Hình 16 và Hình 17.
Hình 16. Sơ đồ quá trình phân lập và dịng hóa cDNA mã hóa yếu tố đơng máu IX (FIX).
Hình 17. Sơ đồ quy trình thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa FIXnoSP và biểu