Chƣơng 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp
2.2.7. Ghép nối DNA
Cơ sở lý thuyết
Dưới sự xúc tác của enzyme T4 DNA ligase, các cầu nối phosphodieste sẽ được hình thành giữa hai nucleotide sát cạnh nhau trên cùng một mạch (gốc phosphat đầu 5’ của nucleotide đoạn DNA này với gốc hydroxyl đầu 3’ của nucleotide của đoạn DNA kia), đồng thời giải phóng một phân tử nước.
Quy trình
Thành phần của một phản ứng ghép nối (10 µl):
Thành phần Thể tích (µl)
T4 DNA ligase buffer 10X 1
Sản phẩm PCR 4
DNA plasmid 1
T4 DNA ligase 1
H2O 3
Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 160C trong khoảng 3 giờ.
2.2.8. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phƣơng pháp sốc nhiệt
Cơ sở lý thuyết
Dưới tác dụng của CaCl2 0,1 M, thành tế bào vi khuẩn E.coli đang ở giai
đoạn sinh trưởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho DNA có thể chui qua các lỗ xốp trên màng tế bào chất khi thay đổi nhiệt độ đột ngột.
Quy trình
Tạo tế bào khả biến cho mục đích chọn dịng:
Cấy chuyển một khuẩn lạc E.coli DH5α trong 5 ml môi trường LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 370C qua đêm.
Chuyển 0,5 ml dịch nuôi tế bào qua đêm sang 50 ml môi trường LB lỏng (pha loãng 100 lần dung dịch tế bào ban đầu), tiếp tục ni lắc ở 200 vịng/phút, 370C đến khi OD600 nm đạt 0,4 - 0,6. Dịch nuôi cấy sau khi chuyển sang ống ly tâm được để trong đá 20 phút.
Ly tâm 4.000 vòng/phút ở 40C trong 10 phút, loại bỏ dịch, thu cặn tế bào.
Tế bào sau khi ly tâm được hòa trong 50 ml CaCl2 0,1 M lạnh. Ủ 35 phút ở 00C, ly tâm 4.000 vòng/phút ở 40C trong 10 phút để thu tế bào.
Hoàn tan tế bào vào 25 ml CaCl2 0,1 M lạnh. Ủ 25 phút ở 00C, ly tâm 4.000 vòng/phút ở 40C trong 10 phút để thu tủa tế bào.
Hòa tế bào vào 1200 µl dung dịch chứa (800 µl CaCl2 0,1 M và 400 µl glycerol 60%).
Chia vào các ống eppendorf 1,5 ml, mỗi ống 80 µl dịch tế bào cho ngay vào nitơ lỏng và bảo quản ở -800C.
Tạo tế bào khả biến cho mục đích biểu hiện gen:
Cấy chuyển một khuẩn lạc E.coli BL21(DE3) trong 5 ml môi trường LB
Chuyển 0,5 ml dịch nuôi tế bào qua đêm sang 50 ml môi trường LB lỏng (pha loãng 100 lần dung dịch tế bào ban đầu), tiếp tục ni lắc ở 200 vịng/phút, 370C đến khi OD600 nm đạt 0,4 - 0,6. Dịch nuôi cấy sau khi chuyển sang ống ly tâm được để trong đá 20 phút.
Ly tâm 4.000 vòng/phút ở 40C trong 10 phút, loại bỏ dịch, thu cặn tế bào.
Tế bào sau khi ly tâm được hòa trong 50 ml CaCl2 0,1 M lạnh. Ủ 35 phút ở 00C, ly tâm 4.000 vòng/phút ở 40C trong 10 phút để thu tế bào.
Hòa tế bào vào 1200 µl dung dịch chứa (800 µl CaCl2 0,1 M và 400 µl glycerol 60%).
Chia vào các ống eppendorf 1,5 ml, mỗi ống 80 µl dịch tế bào ngay vào nitơ lỏng và bảo quả ở -800C.
Biến nạp:
Tế bào khả biến được lấy ra từ -800C và được làm tan trên đá trong 30 phút (tránh sốc nhiệt).
Bổ sung vào mỗi ống tế bào khả biến 4 µl mẫu sản phẩm ligation (DNA + Vector + T4 DNA ligase), đảo nhẹ nhàng để DNA phân bố đều trong dịch tế bào khả biến. Sau đó, đặt tồn bộ trên đá trong thời gian 15 phút. Đối với quá trình biến nạp vào tế bào biểu hiện thì sản phẩm được biến nạp chính là plasmid tái tổ hợp (pET32a/FIXnoSP) đã được tách dòng.
Sốc nhiệt: Mẫu đang đặt trên đá được chuyển ngay sang bể ổn nhiệt có nhiệt
độ 420C trong 70 giây với sản phẩm ligation. Đối với tế bào khả biến cho sự biểu hiện gen [BL21(DE3)] thì biến nạp ở nhiệt độ 420C trong thời gian từ 45 giây. Sau đó mẫu được lấy ra và đặt ngay lên đá lạnh trong thời gian 5 phút. Bổ sung 0,5 ml SOC, lắc hỗn hợp tế bào ở 370C trong 60 phút.
Hút toàn bộ dịch tế bào và cấy trải trên đĩa mơi trường LB đặc có chứa kháng sinh Amp 100 µg/ml. Ủ đĩa ở 370C qua đêm.
2.2.9. Tách chiết DNA plasmid
Cơ sở lý thuyết
Phương pháp tách chiết DNA plasmid dựa trên nguyên lý sử dụng các hóa chất (SDS, NaOH) có tác dụng phá vỡ cấu trúc thành tế bào vi khuẩn, biến tính các phân tử protein và giải phóng các plasmid của vi khuẩn. Khi thay đổi giá trị pH của dịch chiết tế bào bằng dung dịch có chứa kali-acetat, các phân tử protein và DNA hệ gen sẽ bị tủa, tách ra khỏi dung dịch bằng ly tâm tốc độ cao. RNA được loại bỏ bằng cách bổ sung RNase.
Quy trình
Cấy chuyển 1khuẩn lạc của tế bào E.coli mang plasmid cần tách vào trong
ống nghiệm chứa 1,7 ml mơi trường LB có bổ sung Amp (100 µg/ml), ni lắc qua đêm ở 370C, 200 vịng/phút.
Chuyển 1,5 ml dịch ni cấy vào ống eppendorf loại 1,5 ml, ly tâm 6 phút tốc độ 7.000 vòng/phút. Loại bỏ dịch nổi thu tế bào.
Hòa đều tế bào thu được với 150 µl dung dịch Sol I bằng máy vortex, để trên đá 5 phút.
Bổ sung 200 µl dung dịch Sol II, đảo đầu ống eppendorf nhanh, nhẹ nhàng để tránh đứt gẫy DNA, ủ trên đá 5 phút.
Bổ sung tiếp 150 µl dung dịch Sol III và đảo nhẹ 5 lần, trong hỗn hợp sẽ xuất hiện kết tủa trắng, ủ trong đá 5 phút.
Ly tâm 15 phút với tốc độ 12.000 vòng/phút, 40
C.
Thu dịch nổi và chuyển sang ống eppendorf mới. Bổ sung 500 µl dung dịch phenol/chloroform, trộn thật đều và ly tâm 15 phút, tốc độ 12.000 vòng/phút.
Hút pha trên chuyển sang ống eppendorf và lặp lại bước trên với 450 µl hỗn hợp chloroform: isoamyl alcohol (24:1).
Tủa dịch pha trên với 2,5 lần thể tích ethanol 100%, thêm dung dịch muối natri acetate (pH 5,2) tới nồng độ cuối cùng là 0,3 M. Để dung dịch kết tủa ở -200C
Thu DNA kết tủa bằng cách ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Phần tủa DNA được rửa 2 lần với ethanol 70%, mỗi lần 1 ml và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút.
Tủa DNA được làm khơ bằng máy Speed-Vac, hịa tan DNA plasmid bằng 50 µl H2O có chứa RNase nồng độ cuối cùng là 10 µg/ml, ủ hỗn hợp ở 370C trong thời gian 30 phút.
Điện di kiểm tra DNA plasmid trên gel agarose 0,8%.
2.2.10. Xác định trình tự DNA
Nguyên tắc chung
Trình tự nucleotide quan tâm được xác định trên nguyên tắc của phương pháp Sanger: tạo ra các đoạn DNA một sợi hơn kém nhau một nucleotide, kết thúc bởi các ddNTP đã được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để xác định trình tự như dNTP, ddNTPs, DNA polymerase... Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sản phẩm PCR hoặc DNA plasmid tinh sạch) và mồi phù hợp. Phản ứng được thực hiện trong một ống vì 4 loại ddNTP đã được đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng khuếch đại gen để đọc trình tự bao gồm: Mồi 3,2 pM, DNA plasmid 200 ng, BigDye và đệm tương ứng với tổng thể tích 15 μl.
Chu trình nhiệt
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR trong máy GenAmp® PCR System 9700 như sau: 96o
C – 1 phút; (96oC – 10 giây; 50oC – 5 giây; 60oC – 4 phút)x 25 chu kỳ. Sau đó giữ sản phẩm ở 4oC.
Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phƣơng pháp EtOH/EDTA
Bổ sung vào sản phẩm PCR 5 μl EDTA 125 mM, 60 μl EtOH 100% và để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Sau đó, ly tâm 12.000 vịng/phút trong 15
Loại bỏ EtOH, rửa tủa bằng 60 μl EtOH 70%. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút.
Làm khô tủa và bổ sung 10 μl Hi-DiTM Formamide để biến tính ở 95oC trong 5 phút.
Sau bước này, nguyên liệu được đưa vào máy đọc trình tự tự động ABI PRISMTM 3100 Genetic Analyzer.
Các ống được điện di trong ống vi mao quản 80 cm x 50 μl.
Kết quả được thu nhận và xử lý bằng phần mềm ABI PRISMTM 3100 – Avant Data Collection v2.0 và DNA Sequencing Analysis 5.2.
Phân tích trình tự gen
Kết quả nhận được phân tích trên máy tính bằng các phần mềm Sequencing Analysis 5.2; Bioedit 7.0; Seqscape 2.5. Từ các chương trình này tiến hành:
So sánh trình tự của đoạn DNA với trình tự chuẩn.
Phân tích những sai khác để đưa ra những dự đốn cần thiết.
2.2.11. Biểu hiện gen mã hóa cho protein FIX
Sau khi các plasmid tái tổ hợp (pET32a; pET32a/FIXnoSP) được biến nạp vào chủng E. coli BL 21(DE3), chọn các khuẩn lạc phát triển tốt nhất trên đĩa môi
trường chọn lọc LBA và nuôi cấy lắc qua đêm vào môi trường LBA qua đêm ở 37oC, 200 vòng/phút. Hịa dịch ni cấy qua đêm vào mơi trường LBA theo tỷ lệ 1% và nuôi cấy ở cùng điều kiện trên trong khoảng thời gian 2h đến khi OD600nm của dịch tế bào đạt 0,6 - 0,8 thì bổ sung IPTG vào mơi trường ni cấy với nồng độ cuối cùng là 0,5 mM. Nuôi tiếp tục khoảng 3h ở 37oC, 200 vòng/phút để tổng hợp FIXnoSP-Trx. Mẫu tế bào được thu ở các thời điểm 0h, 1h và 3h sau cảm ứng. Tế bào được thu bằng cách ly tâm 6.000 vòng/phút trong thời gian 5 phút. Màng ngoài tế bào được phá bằng siêu âm. Mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp được kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE.
2.2.12. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE
SDS-PAGE được thực hiện theo phương pháp của Laemmli UK, 1970 với các thiết bị của hãng Bio-Rad [40]. Để phân tách các protein có trọng lượng từ 12 - 68 kDa, chúng ta sử dụng gel ở nồng độ 10%, 12,5% và 15% (w/v). SDS-PAGE được tiến hành trên gel 12,5% như ở Bảng 7.
Bảng 7. Thành phần các loại gel sử dụng trong điện di SDS-PAGE. Thành phần
Gel gom mẫu 5%
2 ml: 0,5 ml 0,5M Tris-HCl pH 6,8; 10l 10% (w/v) SDS; 0,35 ml 30%
(w/v) acrylamide; 1,3 ml H2O; 20 l 10% (w/v) APS; 2 l TEMED Gel phân tách
12,5%
4,5 ml: 1,125 ml 1,5 M Tris-HCl pH 8,8; 45 l 10% (w/v) SDS; 0,9 ml 50%
glycerol; 1,89 ml 30% (w/v) acrylamide; 0,55 ml H2O; 30 l 10% (w/v) APS; 3 l TEMED
Đệm mẫu 5x 25% (v/v) glycerol; 14,4 mM β-mercaptoethanol; 2% (w/v) SDS; 0,1 (w/v) bromophenol blue; 60 mM Tris-HCl pH 6,8
Đệm điện di 25 mM Tris-HCl; 192 mM glycine; 0,1% (w/v) SDS; pH 8,3 Thang protein
chuẩn (kDa)
β-galactosidase (116), albumin huyết thanh bò (66.2), ovalbumin (45), lactate dehydrogenase (35), endonuclease giới hạn (25), lysozyme (14.4)
Để phân tích mức độ biểu hiện của protein, các bản gel được nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue (CBB). Sau khi ủ với dung dịch nhuộm trong 30 phút, bản gel được tẩy rửa bằng dung dịch tẩy cho đến khi có thể quan sát thấy các băng protein.
2.3. Sơ đồ thí nghiệm
Nội dung nghiên cứu được chia làm hai phần và thực hiện qua các bước sau:
a. Phân lập gen mã hóa yếu tố đơng máu IX từ mô gan sinh thiết ở người
Tách chiết RNA tổng số từ mô gan sinh thiết của người bằng trizol.
Tổng hợp cDNA từ RNA tổng số nhờ việc sử dụng mồi Oligo (dT) và enzyme phiên mã ngược SuperScriptTM
II Reverse Transcriptase (RT).
Khuếch đại tồn bộ cDNA mã hóa FIX bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu (F1/R1) đã được thiết kế dựa trên trình tự có sẵn của gen FIX trên ngân hàng
gen quốc tế GenBank (mã số NM_000133).
Ghép nối cDNA mã hóa FIX với vector tách dịng pJET1.2 tạo plasmid tái tổ hợp, kí hiệu là pJET1.2/FIX và biến nạp sản phẩm ghép nối này và tế bào khả biến
E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt.
Kiểm tra cDNA mã hóa FIX trong vector tách dòng bằng enzyme hạn chế và giải trình tự.
b. Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa FIXnoSP và biểu hiện trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21(DE3)
Nhân đoạn cDNA mã hóa FIX với chuỗi polypeptide cắt tín hiệu tiết đầu N, (kí hiệu là FIXnoSP) từ khn là plasmid tái tổ hợp pJET1.2/FIX bằng cặp mồi đặc
hiệu (F4/R5).
Cắt sản phẩm PCR bằng các enzyme hạn chế, đồng thời cắt vector pET32a bằng các enzyme hạn chế tương ứng.
Ghép nối đoạn cDNA mã hóa FIXnoSP vào vector biểu hiện pET32a tạo plasmid tái tổ hợp pET32a/ FIXnoSP và biến nạp vào chủng biểu hiện E. coli DH5α
bằng phương pháp sốc nhiệt. Theo cách thiết kế này, FIXnoSP sẽ được biểu hiện ở dạng dung hợp với TrxA.
Biến nạp các vector tái tổ hợp (pET32a và pET32a/ FIXnoSP) vào chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt.
Cảm ứng biểu hiện protein dung hợp.
Kiểm tra protein dung hợp bằng phương pháp điện di SDS-PAGE.
Quy trình phân lập và biểu hiện gen mã hóa yếu tố đông máu IX trong tế bào
E.coli BL21(DE3) được tóm tắt ở Hình 16 và Hình 17.
Hình 16. Sơ đồ q trình phân lập và dịng hóa cDNA mã hóa yếu tố đơng máu IX (FIX).
Hình 17. Sơ đồ quy trình thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa FIXnoSP và biểu
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập gen mã hóa yêu tố đông máu IX ở ngƣời 3.1.1. Thu thập mẫu mô gan sinh thiết ngƣời
Do yếu tố đông máu IX người được tổng hợp chủ yếu ở các tế bào mô gan nên chúng tôi đã chọn mô gan làm nguyên liệu nghiên cứu. Phối hợp với Bệnh viện K, chúng tôi đã chọn được mẫu mô gan sinh thiết từ 2 trong số 7 người (Bảng 8) dùng cho việc tách RNA tổng số để phân lập gen FIX.
Bảng 8. Danh sách người cho mẫu.
STT Tên Giới tính Tuổi Mẫu mô gan (g)
1 Lương Mỹ H. Nữ 28 2-3
2 Nguyễn Tuấn N. Nam 30 2-3
3.1.2. Tách chiết RNA tổng số
Sản phẩm RNA tổng số tách chiết từ 2 mẫu mô gan sinh thiết bằng phương pháp trizol được điện di biến tính trên gel agarose 1% (Hình 18). Kết quả điện di thể hiện rõ các băng 28S, 18S và 5S rRNA, khơng có hiện tượng bị phân hủy do quá trình tách chiết.
Hình 18. Điện di đồ sản phẩm RNA tổng số trên gel agarose 1%.
Như vậy, chúng tôi đã tách chiết được RNA tổng số từ 2 mẫu mô sinh tiết gan ở người. Mẫu RNA tổng số tách từ mẫu mô gan sinh thiết của Lương Mỹ H. được sử dụng làm nguyên liệu cho việc tổng hợp cDNA mã hóa FIX ở người.
3.1.3. Tạo dịng và xác định trình tự gen FIX
Thiết kế cặp mồi và PCR
Để phân lập được đoạn cDNA mã hóa cho protein FIX từ RNA tổng số, cần phải có một cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng nhân gen FIX bằng kỹ thuật PCR từ
cDNA sợi đơn được tổng hợp từ phản ứng RT-PCR. Trên cơ sở trình tự mRNA mã hóa protein FIX của người đã công bố trên Ngân hàng trình tự gen Quốc tế GENBANK/DDBJ/EMBL (mã số NM_000133), chúng tôi đã thiết kế cặp mồi nhân cDNA mã hóa FIX như sau:
FIX-F1: 5’ - GCT AGC AAA GGT TAT GCA GCG C -3’ FIX-R1: 5’- GGA AAT CCA TCT TTC ATT AAG TG -3’
Từ nguồn RNA tổng số đã tách được, chúng tôi đã tiến hành làm phản ứng tổng hợp cDNA sợi đơn từ RNA tổng số này thông qua việc sử dụng Oligo(dT) và enzyme phiên mã ngược SuperScriptTM
II Reverse Transcriptase (RT). Sau đó, mẫu cDNA tổng số này được dùng làm khuôn cho phản ứng nhân cDNA mã hóa cho FIX bằng enzyme Pfu cùng với cặp mồi đặc hiệu (F1/R1). Chúng tôi sử dụng enzyme Pfu DNA polymerase với mục đích là hạn chế tối thiểu việc tạo ra các đột biến điểm không mong muốn trong quá trình nhân cDNA. Trong phản ứng nhân cDNA mã hóa FIX, chúng tơi đã tối ưu được nhiệt độ thích hợp nhất cho việc gắn mồi là 55oC. Sản phẩm RT-PCR sau đó được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 19).