Chế độ ion hóa ESI (+)
Điện thế ion hố (V) 5000
Khí phun sương (psi) 35
Khí tăng cường (psi) 65
Nhiệt độ hố hơi (°C) 65
Khí thổi (psi) 100
3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký
Khảo sát trên các cột Hypersil Gold C18 50 x 2,1 mm;, cột Hypersil Gold C8 50 x 2,1 mm; 1,9 µm, Cột Luna C18(2)-HST 50 x 3 mm; 2,5 µm nhận thấy cột Hypersil Gold C8 50 x 2,1 mm; 1,9 µm cho pic cân đối, tín hiệu đo của pic cao hơn. Do đó cột Hypersil Gold C8 50 x 2,1 mm; 1,9 µm được lựa chọn để cho các nghiên cứu khảo sát về sau.
Các hệ pha động khác nhau gồm MeOH:axit formic 0,1%, MeOH:amoni axetat 2 – 10 mM, MeOH:amoni bicacbonat 1 – 10 mM, MeCN:axit formic 0,1%, MeCN:amoni axetat 2 – 10 mM, MeCN:amoni bicacbonat 1 – 10 mM được lựa chọn khảo sát cho thấy hệ pha động MeCN:amoni axetat 2 mM,
MeCN:amoni bicacbonat 1 mM, với tỷ lệ MeCN từ 80 – 90% cho hình dáng pic, tín hiệu đo pic tốt nhất.
Khi thay đổi tỷ lệ của pha động gồm MeCN:amoni axetat (8:2), pic VDG có cường độ tín hiệu giảm và xuất hiện hơi nước ngưng tụ ở buồng ion hóa. Tuy nhiên, khi tăng tỷ lệ dung dịch MeCN:amoni axetat (9:1) pic của VDG có cường độ tín hiệu cao và ổn định, hình dáng pic cân đối hơn nhưng nền mẫu cao (1e3). Như vậy, khi sử dụng hệ pha động MeCN:amoni axetat, chất phân tích bị ảnh hưởng của nền mẫu, làm giảm tín hiệu đo.
Hình 3.5. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động MeCN:amoni axetat 2mM (8:2)
Hình 3.6. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động
XIC of +MRM (1 pair): 304.000/154.000 Da ID: Vildagliptin from Sample 1 (Ch... Max. 1.5e5 cps.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 Time, min 0.0 1.0e4 2.0e4 3.0e4 4.0e4 5.0e4 6.0e4 7.0e4 8.0e4 9.0e4 1.0e5 1.1e5 1.2e5 1.3e5 1.4e5 1.5e5 Int ensit y, cps 1.03 0.05
XIC of +MRM (1 pair): 304.000/154.000 Da ID: Vildagliptin from Sample 1 (Ch... Max. 1.5e5 cps.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 Time, min 0.0 1.0e4 2.0e4 3.0e4 4.0e4 5.0e4 6.0e4 7.0e4 8.0e4 9.0e4 1.0e5 1.1e5 1.2e5 1.3e5 1.4e5 1.5e5 Int ensit y, cps 1.03 0.05
Với hỗn hợp pha động MeCN:amoni bicacbonat, khi thay đổi tỷ lệ thành phần pha động thì thời gian lưu, hình dáng pic, tín hiệu đo của VDG thay đổi theo nhưng chất phân tích ít bị ảnh hưởng nền mẫu hơn. Với tỷ lệ MeCN:amoni bicacbonat 1mM (95:5) xuất hiện pic VDG khá nhiễu, đuôi pic kéo dài; MeCN:amoni bicacbonat 1mM (90:10) và MeCN:amoni bicacbonat 2mM (80:20) pic của VDG xấu, nền mẫu cao. Ngược lại khi thành phần pha động MeCN:amoni bicacbonat 1mM (85:15) thì pic VDG cân đối và thời gian phân tích phù hợp. Do đó, tỷ lệ MeCN:amoni bicacbonat 1mM (85:15) được lựa chọn làm thành phần pha động tối ưu.
Hình 3.7. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động MeCN:amoni bicacbonat 1mM (95:5)
Hình 3.8. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động MeCN:amoni bicacbonat 1mM (90:10)
XIC of +MRM (1 pair): 304.000/154.000 Da ID: Vildagliptin from Sample 1 (... Max. 2.4e4 cps.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 Time, min 0.0 2000.0 4000.0 6000.0 8000.0 1.0e4 1.2e4 1.4e4 1.6e4 1.8e4 2.0e4 2.2e4 2.4e4 Int ens ity, cp s 0.92
XIC of +MRM (1 pair): 304.000/154.000 Da ID: Vildagliptin from Sample 1 (... Max. 2.6e4 cps.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 Time, min 0.0 2000.0 4000.0 6000.0 8000.0 1.0e4 1.2e4 1.4e4 1.6e4 1.8e4 2.0e4 2.2e4 2.4e4 2.6e4 Int ens ity, cp s 0.85
Hình 3.9. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động MeCN:amoni bicacbonat 2mM (85:15)
Hình 3.10. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động MeCN:amoni bicacbonat 2mM (80:20)
Thể tích tiêm mẫu và tốc độ dịng cũng ảnh hưởng tới pic và tín hiệu đo. Khi thể tích tiêm là 1µL pic của các chất cân đối, tín hiệu đo pic tại nồng độ thấp VDG và IS đạt yêu cầu. Với tốc độ dòng 0,4mL/phút, các pic VDG có hình dáng cân đối và thời gian phân tích ngắn, đồng thời tín hiệu pic VDG cao.
XIC of +MRM (1 pair): 304.000/154.000 Da ID: Vildagliptin from Sample 1... Max. 9407.0 cps.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 Time, min 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 9407 Int ens it y, cp s 0.77 0.54 0.90 0.43
Từ kết quả thực nghiệm ở trên, điều kiện sắc ký để định lượng VDG và IS trên hệ thống LC-MS/MS được lựa chọn như sau:
• Cột Hypersil Gold C8 50 x 2,1 mm; 1,9 àm
ã Pha động MeCN: amoni bicacbonat 1mM (85: 15)
• Tốc độ dịng: 0,4 mL/phút
• Thể tích tiêm: 1µL
Như vậy, với hệ thống sắc ký lỏng siêu năng ở các điều kiện tối ưu ở trên, quy trình tách diễn ra tương đối nhanh và tiêu tốn ít dung mơi hóa chất, do đó ít gây ơ nhiễm mơi trường hơn so với các phương pháp HPLC định lượng VDG khác [8, 9, 11]. Hơn nữa, thời gian phân tích một mẫu khoảng 2 phút nên phương pháp LC-MS/MS đã góp phần giảm đáng kể tổng thời gian phân tích khi số lượng mẫu huyết tương nhiều, vì vậy sẽ rất phù hợp để áp dụng phân tích các mẫu trong các nghiên cứu sinh khả dụng (SKD) và tương đương sinh học (TĐSH) (Hình 3.11)
3.1.3. Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu huyết tương
Tiến hành chuẩn bị các mẫu huyết tương tự tạo chứa chuẩn VDG và IS. Xử lý các mẫu trắng và mẫu chuẩn theo bằng phương pháp kết tủa protein.
Sử dụng điều kiện sắc ký đã khảo sát, đánh giá quy trình xử lý mẫu ở trên với tỷ lệ dung môi khác nhau (1:3; 1:4; 1:10). Qua q trình phân tích mẫu thấy được xử lý mẫu với tỷ lệ dung môi 1:3 dung dịch sau ly tâm hơi vẩn đục, tỷ lệ 1:10 mẫu sạch nhưng mẫu bị pha lỗng nhiều ảnh hưởng tín hiệu đo pic. Vì vậy đã lựa chọn tỷ lệ 1:4 cho tín hiệu đo tốt, nền mẫu sạch.
So với kỹ thuật chiết SPE [11] để định lượng VDG, phương pháp xử lý mẫu này đơn giản, kinh tế và dễ thực hiện hơn.
So với phương pháp chiết LLE [5, 7] mẫu thu được bằng phương pháp kết tủa protein, tác nhân tạo kết tủa là MeCN, thời gian phân tích ngắn, đơn giản, dễ thực hiện, tiết kiệm chi phí.
Do vậy, quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp kết tủa protein được tối ưu hoá và thể hiện trên sơ đồ như sau:
Hình 3.12. Quy trình xử lý mẫu
250 µL mẫu huyết tương
Lắc xốy 10s Ly tâm 6500 vịng/phút x 5 phút Hút lớp dịch trong Tiêm sắc ký +25µL IS + 1mL MeCN
3.1.4. Xây dựng phương pháp định lượng VDG trong huyết tương
Từ các kết quả nêu trên, phương pháp LC-MS/MS định lượng VDG trong huyết tương người bao gồm xử lý mẫu bằng phương pháp kết tủa protein, sau đó phân tích định lượng bằng LC-MS/MS được xây dựng tối ưu như sau:
3.1.4.1. Quy trình xử lý mẫu huyết tương
Bảng 3.2 trình bày tổng hợp các điều kiện sắc ký áp dụng phân tích VDG và IS. Quy trình được tiến hành như sau: Hút 250 µL HT + 25 µL dung dịch IS làm việc. Sau đó, thêm 1 mL MeCN, lắc xốy 10 giây, rồi tiến hành ly tâm 6500 vòng/phút x 5 phút. Hút lấy lớp dịch nổi và tiến hành tiêm sắc ký.