STT Thời gian (h) Tín hiệu pic VDG Tín hiệu pic IS Tỷ lệ tín hiệu pic VDG/IS Nồng độ (ng/mL) 1 0 0 3877974 0,000 0,0 2 0,25 991144 3176727 0,312 34,1 3 0,5 5220754 3069280 1,701 184,3 4 0,75 8581218 2931320 2,927 316,9 5 1 11550467 2960969 3,901 422,1 6 1,33 14310296 3068712 4,663 504,5 7 1,67 12853375 2943971 4,366 472,4 8 2 11317745 2916461 3,881 419,9 9 2,5 10093229 3134933 3,220 348,5 10 3 8056870 2974747 2,708 293,2 11 4 6234188 2934883 2,124 230,0 12 6 3795682 2621006 1,448 156,9 13 8 2077215 2666146 0,779 84,6 14 12 449601 2842672 0,158 17,5 15 15 110889 2856774 0,039 4,6 16 24 9093 2942873 0,003 0,7* Cmax (ng/mL) 504,5 Tmax (h) 1,33
T1/2 (h) 1,67
AUClast (ng/mL*h) 2132,7
AUCinf (ng/mL*h) 2143,7
% AUClast/AUCinf 99,5%
Ghi chú: (*): Dưới giới hạn định lượng dưới
Hình 3.19. Sắc ký đồ mẫu huyết tương NTN trước khi uống thuốc
XIC of +MRM (2 pairs): 304.000/154.000 Da ID: Vil... Max. 1270.0 cps.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 Time, min 0.00 5.00e5 1.00e6 1.23e6 Int en sit y, .. . 0.40 0.57 0.61 0.96 1.07 0.01 0.16 0.27 0.42 0.72 0.86 1.181.221.34 1.38 1.561.59
XIC of +MRM (2 pairs): 237.000/194.000 Da ID: Car... Max. 1.2e6 cps.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 Time, min 0.00 5.00e5 1.00e6 1.23e6 Int en sit y, . .. 0.47
XIC of +MRM (2 pairs): 304.000/154.000 Da ID: Vil... Max. 1270.0 cps.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 Time, min 0 500 1000 1270 Int en sit y, . .. 0.40 0.57 0.96 0.61 1.07 0.01 0.42 0.86 1.18 1.22 1.56 0.49 0.72 1.34 1.38 0.27 0.16 1.59
Hình 3.20. Sắc ký đồ mẫu huyết tương NTN sau khi uống thuốc 1,33 giờ
Hình 3.21. Sắc ký đồ mẫu huyết tương NTN sau khi uống thuốc 12 giờ
XIC of +MRM (2 pairs): 304.000/154.000 Da ID: Vild... Max. 4.4e6 cps.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 Time, min 0.0 1.0e6 2.0e6 3.0e6 4.0e6 Int en sit y, .. . 0.53
XIC of +MRM (2 pairs): 237.000/194.000 Da ID: Car... Max. 1.3e6 cps.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 Time, min 0.0 5.0e5 1.0e6 1.3e6 Int en sit y, . .. 0.47
XIC of +MRM (2 pairs): 304.000/154.000 Da ID: Vild... Max. 4.4e6 cps.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 Time, min 0.0 1.0e6 2.0e6 3.0e6 4.0e6 Int en sit y, . .. 0.53
XIC of +MRM (2 pairs): 304.000/154.000 Da ID: Vild... Max. 1.4e5 cps.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 Time, min 0.00 2.00e5 4.00e5 6.00e5 8.00e5 1.00e6 1.17e6 Int en sit y, .. . 0.53
XIC of +MRM (2 pairs): 237.000/194.000 Da ID: Car... Max. 1.2e6 cps.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 Time, min 0.00 2.00e5 4.00e5 6.00e5 8.00e5 1.00e6 1.17e6 Int en sit y, . .. 0.47
XIC of +MRM (2 pairs): 304.000/154.000 Da ID: Vild... Max. 1.4e5 cps.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 Time, min 0.0 5.0e4 1.0e5 1.4e5 Int en sit y, . .. 0.53
Hình 3.22. Sắc ký đồ mẫu huyết tương NTN sau khi uống thuốc 24 giờ
Hình 3.23. Đường cong nồng độ VDG trong mẫu huyết tương của NTN theo thời gian
XIC of +MRM (2 pairs): 304.000/154.000 Da ID: Vil... Max. 2900.0 cps.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 Time, min 0.00 5.00e5 1.00e6 1.21e6 Int en sit y, .. . 0.52 0.40 0.27 0.76 0.79 0.94 1.04 1.171.20 1.33 1.51 0.05 0.19 0.65 1.38 1.60
XIC of +MRM (2 pairs): 237.000/194.000 Da ID: Car... Max. 1.2e6 cps.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 Time, min 0.00 5.00e5 1.00e6 1.21e6 Int en sit y, . .. 0.47
XIC of +MRM (2 pairs): 304.000/154.000 Da ID: Vil... Max. 2900.0 cps.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 Time, min 0 500 1000 1500 2000 2500 2900 Int en sit y, . .. 0.52 0.40 0.27 0.76 0.79 0.94 1.04 1.171.20 1.33 1.51 0.05 0.19 1.38 1.60 0 100 200 300 400 500 600 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 N ồn g độ V D G ( ng /m L) Thời gian (h)
Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng VDG trong huyết tương một người tình nguyện cho thấy:
Trên sắc ký đồ mẫu huyết tương của NTN trước khi uống thuốc (Hình 3.19), khơng có mảnh ion đặc trưng của VDG (m/z 304 → 154) và của IS (m/z 237 → 194) do vậy nền mẫu huyết tương không ảnh hưởng đến độ chọn lọc của phương pháp. Sau khi NTN sử dụng 01 viên VDG 50 mg, trên sắc ký đồ mẫu huyết tương của NTN này đều xuất hiện các pic tương ứng đặc trưng của VDG và IS trong các mẫu chuẩn. Pic của VDG và IS trong các mẫu huyết tương NTN sau khi dùng thuốc có hình dạng cân đối (Hình 3.20, Hình 3.21, Hình 3.22). Như vậy, phương pháp LC-MS/MS đã nghiên cứu có tính đặc hiệu – chọn lọc cao, có thể sử dụng để định lượng VDG trong huyết tương người.
Hầu hết các mẫu đều có nồng độ VDG trên giới hạn định lượng dưới (LLOQ). Giá trị Cmax (504,5 ng/mL) gần bằng nồng độ cao nhất của đường chuẩn (600 ng/mL) nên không phải tiến hành pha lỗng mẫu trong q trình phân tích. Giá trị LLOQ (3 ng/mL) bằng khoảng 1/100 lần giá trị Cmax với mức liều 50 mg. Đa số các mẫu đều nằm trong khoảng tuyến tính được xác nhận giá trị sử dụng (3 – 600 ng/mL). Do đó, khoảng tuyến tính đã xây dựng phù hợp để định lượng nồng độ VDG trong huyết tương người.
Tỷ lệ phần trăm giá trị AUClast/AUCinf là 99,49% (lớn hơn 80%) chứng tỏ thời điểm lấy mẫu đáp ứng yêu cầu của US-FDA [30, 31] và EMA [32] về nghiên cứu tương đương sinh học.
Có ít nhất 2 nồng độ mẫu QC (LQC và MQC) đều nằm trong khoảng nồng độ của NTN làm tăng độ đúng, độ chính xác của kết quả định lượng đáp ứng các yêu cầu của US-FDA và EMA về phân tích thuốc trong dịch sinh học [16- 18], hồn tồn phù hợp để áp dụng phân tích mẫu của NTN.
Giá trị Cmax, Tmax, T1/2 và AUC phù hợp với các tài liệu đã cơng bố. [7, 12, 36, 37]. Vì vậy, phương pháp phân tích VDG đã xây dựng và được xác nhận giá trị sử dụng có thể áp dụng để nghiên cứu dược động học, sinh khả dụng và tương đương sinh học đối với các chế phẩm chứa VDG.
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
Đề tài nghiên cứu của luận văn đã xây dựng thành công phương pháp định lượng VDG trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) sử dụng nguồn ion hóa kiểu phun điện dương (ESI +) theo chế độ đo chọn lọc đa ion (MRM). Quy trình phân tích đã được xác nhận giá trị sử dụng đầy đủ và đạt các yêu cầu của một phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học theo hướng dẫn hiện hành của US-FDA và EMA. Phương pháp có độ nhạy, độ chọn lọc và độ chính xác rất cao, thời gian phân tích ngắn (2 phút cho mỡi mẫu) có giá trị thực tiễn và khả thi để áp dụng định lượng nồng độ VDG trong mẫu huyết tương NTN, đánh giá tương đương sinh học cho các chế phẩm chứa VDG. Mẫu huyết đương được xử lý bằng kỹ thuật kết tủa protein sử dụng dung dịch MeCN sau khi rã đơng ở nhiệt độ phịng. Phương pháp có độ chọn lọc cao với VDG; có giới hạn định lượng dưới (LLOQ) thấp 3 ng/mL (khoảng 1/100 Cmax ở mức liều 50 mg); khoảng nồng độ tuyến tính rộng (3 – 600 ng/mL) trong khoảng từ 1/100 – 1/50 Cmax đến 2 – 3Cmax; không bị ảnh hưởng của nền mẫu với giá trị CV đạt yêu cầu (< 15%); không bị nhiễm chéo; độ đúng cao, độ lặp lại tốt với CV ≤ 15%; độ thu hồi hoạt chất cao và ổn định (trên 92,7%) và ổn định trong các điều kiện bảo quản khác nhau (5 giờ ở nhiệt độ phòng, 1 giờ trong thùng đá (~ 4°C), 75 giờ trong autosampler, sau 6 chu kì đơng – rã và 77 ngày ở nhiệt độ -70°C).
Đề tài đã áp dụng phương pháp trên để xác định nồng độ của VDG trong mẫu huyết tương NTN ở các thời điểm khác nhau với liều 50 mg. Kết quả cho thấy phương pháp phân tích đã xây dựng có tính chọn lọc cao, khoảng tuyến tính phù hợp để định lượng nồng độ VDG trong mẫu huyết tương người. 4.2. KIẾN NGHỊ
Sau khi thực hiện đề tài này, chúng tơi có một số kiến nghị sau:
- Tiếp tục triển khai và áp dụng phương pháp trong các nghiên cứu SKD và TĐSH chế phẩm có chứa dược chất VDG với các hàm lượng khác nhau, các chế phẩm đa thành phần có chứa VDG và theo dõi nồng độ VDG trong điều trị.
- Kỹ thuật LC-MS/MS có những ưu điểm vượt trội về độ nhạy, tính đặc hiệu và chọn lọc. Do vậy, cần tiếp tục mở rộng và ứng dụng kỹ thuật này trong các nghiên cứu SKD và TĐSH, đặc biệt cho các chế phẩm có hàm lượng, liều dùng thấp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] M.F. Abdel-Ghany, O. Abdel-Aziz, M.F. Ayad, M.M. Tadros, 2014, Validation of different spectrophotometric methods for determination of vildagliptin and metformin in binary mixture, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 125, pp. 175-182.
[2] T. Boovizhikannan, V.K. Palanirajan, 2013, RP-HPLC determination of vildagliptin in pure and in tablet formulation, Journal of Pharmacy Research, 7(1), pp. 113-116.
[3] A.A. El-Zaher, H.A. Hashem, E.F. Elkady, M.A. Allam, 2019, A validated LC-MS/MS bioanalytical method for the simultaneous determination of dapagliflozin or saxagliptin with metformin in human plasma, Microchemical
Journal, 149, p 104017.
[4] R. Pontarolo, A.C. Gimenez, T.M.G. de Francisco, R.P. Ribeiro, F.L.D. Pontes, J.C. Gasparetto, 2014, Simultaneous determination of metformin and vildagliptin in human plasma by a HILIC–MS/MS method, Journal of Chromatography B, 965, pp. 133-141.
[5] Trần Tử An, 2007, Hố Phân Tích, Nhà Xuất Bản Y Học, Bộ Y Tế.
[6] National Center for Biotechnology Information, PubChem Compound
Summary for CID 6918527, Vildagliptin,
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Galvus, Accessed 2021.
[7] Y.-L. He, D. Serra, Y. Wang, J. Campestrini, G.-J. Riviere, C.F. Deacon, J.J. Holst, S. Schwartz, J.C. Nielsen, M. Ligueros-Saylan, 2007, Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Vildagliptin in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus, Clinical Pharmacokinetics, 46(7), pp. 577-588.
[8] A. Shakoor, A. Adnan, M. Ahmed, 2019, Simultaneous Determination of Metformin and Vildagliptin by HPLC in Human Plasma: Application to Pharmocokinetic Studies, Latin American Journal of Pharmacy, 38(7), pp.
1416-1423.
[9] A. Pharne, B. Santhakumari, A.S. Ghemud, H. Jain, M. Kulkarni, 2012, Bioanalytical method development and validation of vildagliptin a novel dipeptidyl peptidase iv inhibitor by RP-HPLC method, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 4, pp. 119-123.
[10] C. Hess, F. Musshoff, B. Madea, 2011, Simultaneous identification and validated quantification of 11 oral hypoglycaemic drugs in plasma by electrospray ionisation liquid chromatography–mass spectrometry, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 400(1), pp. 33-41.
[11] M. Attimarad, S.H. Nagaraja, B.E. Aldhubaib, A. Al-Najjar, 2014, Development of a rapid reversed phase-high performance liquid chromatography method for simultaneous determination of metformin and vildagliptin in formulation and human plasma, Journal of Young Pharmacists, 6(4), pp. 40-46.
[12] R.I. ElBagary, H.M.E. Azzazy, E.F. ElKady, F. Farouk, 2016, Simultaneous determination of metformin, vildagliptin, and 3-amino-1- adamantanol in human plasma: Application to pharmacokinetic studies,
Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 39(4), pp. 195-
202.
[13] P. Hu, Q. Yin, F. Deckert, J. Jiang, D. Liu, L. Kjems, W.P. Dole, Y.-L. He, 2009, Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Vildagliptin in Healthy Chinese Volunteers, The Journal of Clinical Pharmacology, 49(1), pp. 39-49. [14] T.M. Annesley, 2003, Ion suppression in mass spectrometry, Clin Chem,
49(7), pp. 1041-1044.
[15] Phạm Luận, 2014, Phương Pháp Phân Tích Sắc Ký Và Chiết Tách, Nhà
xuất bản Bách Khoa Hà Nội.
[16] The United States Pharmacopeia 38 and National Formulary 33, 2015, Volume 1, <1088> In Vivo and In Vitro Evaluation of Dosage Forms, The
United States Pharmacopoeial Convention, Rockville, MD 20852, pp.
[17] The United States Pharmacopeia 38 and National Formulary 33, 2015, Volume 1, <1090> In Vivo Bioequivalence Guidances, The United States
Pharmacopoeial Convention, Rockville, MD 20852, pp.
[18] The United States Pharmacopeia 38 and National Formulary 33, 2015, Volume 1, <1090> Assessment of Drug Product Performance - Bioavailability, Bioequivalence, and Dissolution, The United States
Pharmacopoeial Convention, Rockville, MD 20852, pp.
[19] Bộ Y Tế, 2017, Dược Điển Việt Nam V, PL4, Nhà Xuất Bản Y Học, Hà Nội.
[20] Somenath Mitra, 2003, Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry, 162, John Wiley & Sons, Hoboken, New Jersey.
[21] Wilfried M. A. Niessen, 2006, Liquid Chromatography - Mass Spectrometry, Third ed., CRC/Taylor & Francis, LLC.
[22] David A. Wells, 2003, 5, Chapter 6 Protein precipitation: High throughput techniques and strategies for method development, Progress in
[23] E. Rogatsky, D. Stein, 2005, Evaluation of Matrix Effect and Chromatography Efficiency: New Parameters for Validation of Method Development, Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 16(11), pp. 1757-1759.
[24] R.R. Burgess, 2009, 463, Chapter 20 Protein Precipitation Techniques,
in: R.R. Burgess, M.P. Deutscher (Eds.), Methods in Enzymology, Academic Press, 331-342.
[25] R. dos Santos, A.L. Carvalho, A.C.A. Roque, 2017, Renaissance of protein crystallization and precipitation in biopharmaceuticals purification,
Biotechnology Advances, 35(1), pp. 41-50.
[26] S. Liu, Z. Li, B. Yu, S. Wang, Y. Shen, H. Cong, 2020, Recent advances on protein separation and purification methods, Advances in Colloid and Interface Science, 284, p 102254.
[27] P.L. Kole, G. Venkatesh, J. Kotecha, R. Sheshala, 2011, Recent advances in sample preparation techniques for effective bioanalytical methods,
Biomedical Chromatography, 25(1‐2), pp. 199-217.
[28] O.S. Ahmed, Y. Ladner, C. Bousquet, J. Montels, P. Dubský, L. Philibert, C. Perrin, 2020, Direct salting-out assisted liquid–liquid extraction (SALLE) from human blood: Application for the analysis of tyrosine kinase inhibitors,
Microchemical Journal, 155, p 104791.
[29] N. Li, T. Zhang, G. Chen, J. Xu, G. Ouyang, F. Zhu, 2021, Recent Advances in Sample Preparation Techniques for Quantitative Detection of Pharmaceuticals in Biological Samples, TrAC Trends in Analytical Chemistry, p 116318.
[30] FDA, 2003, Guidance for Industry - Bioavailability and Bioequivalence Studies for Orally Administered Drug Products - General Considerations, U.S. Department of Health and Human Services.
[31] FDA, 2018, Bioanalytical Method Validation: Guidance for Industry, U.S. Department of Health and Human Services.
[32] European Medicines Agency, 2012, Guideline on Bioanalytical Method Validation.
[33] The Pharmacopoeia of the People’s Republic of China, 2005, Volume II,
Guidances in vivo Bioavailability and Bioequivalence Studies for Drug Preparations, in: C.P. Commission (Ed.), People's Medical Publishing House,,
A207-A210.
[34] ASEAN, 2015, ASEAN Guideline for The Conduct of Bioequivalence Studies.
[35] N. Kumar, S.R. Devineni, G. Singh, A. Kadirappa, S.K. Dubey, P. Kumar, 2016, Identification, isolation and characterization of potential process-related impurity and its degradation product in vildagliptin, Journal of Pharmaceutical
and Biomedical Analysis, 119, pp. 114-121.
[36] Y.-L. He, R. Sabo, G. Sunkara, M.-N. Bizot, G.-J. Riviere, S. Leon, M. Ligueros-Saylan, W.P. Dole, D. Howard, 2007, Evaluation of Pharmacokinetic Interactions Between Vildagliptin and Digoxin in Healthy Volunteers, The Journal of Clinical Pharmacology, 47(8), pp. 998-1004.
[37] K. Sakthimanigandan, M. Ganesh, V. Kanthikiran, T. Sivakumar, H. Jang, 2015, Liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method for the determination of Vildagliptin in rat plasma, Acta Chromatographica, 27(2), pp. 295-307.
PHỤ LỤC
1. Chứng chỉ phân tích của các chất chuẩn
2. Sắc ký đồ của các mẫu huyết tương NTN trước và sau khi uống thuốc 3. Sắc ký đồ của mẫu đường chuẩn và mẫu kiểm tra