Điều kiện khối phổ và lựa chọn chuẩn nội để định l- 123docz.net

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

3.1.1. Điều kiện khối phổ và lựa chọn chuẩn nội để định lượng Vildagliptin

Vildagliptin

Nghiên cứu trong luận văn sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) để phân tích định tính và định lượng VDG trong mẫu huyết tương. So với kỹ thuật khối phổ một lần để định lượng VDG trong dịch sinh học thì phổ khối hai lần MS/MS có ưu điểm vượt trội hơn về tính đặc hiệu, giới hạn phát hiện, độ chọn lọc và độ nhạy khi phân tích lượng vết. Do đó, các điều kiện về khối phổ được lựa chọn, khảo sát để xác định điều kiện tối ưu khi phân tích VDG.

3.1.1.1. Điều kiện khối phổ định lượng Vildagliptin

- Ion hóa VDG và phổ khối MS:

Khảo sát chế độ ion hoá ESI (+) và ESI (-) và tiến hành phân tích khối phổ một lần và quét toàn phổ (Full scan MS). Tại chế độ ESI (+) xác định được mảnh ion mẹ (parent ion) của VDG là m/z 304,0. Tại chế độ ESI (-) khơng có tín hiệu ứng với VDG. Vì vậy, lựa chọn phân tích VDG tại chế độ ESI (+). Phổ khối của các chất phân tích tại chế độ ESI (+) được thể hiện ở Hình 3.1 và cơ chế phân mảnh của VDG trong phổ khối đã được Kumar và cộng sự [35] đề xuất như trình bày ở Hình 3.2. Trên phổ khối của VDG, mảnh mẹ [M+H]+ (m/z 304) xuất hiện rõ nét, tín hiệu lớn nhất do đó được chọn làm mảnh ion mẹ để xác định phổ khối của các mảnh ion con. Cũng theo phổ khối từ mảnh mẹ [M+H]+ thu được cả pic của các mảnh con tại các m/z 154, m/z 127, m/z 97, m/z 70 hoàn toàn phù hợp với cơ chế phân mảnh đã được đề xuất bởi Kumar và các cộng sự.

Hình 3.1. Phổ khối của dung dịch chuẩn VDG với chế độ ESI (+)

Hình 3.2. Cơ chế phân mảnh của Vildagliptin

Sau khi xác định được mảnh ion mẹ, các thông số nguồn ion với chất phân tích được khảo sát và lựa chọn tối ưu. Tiến hành khảo sát các thông số: điện thế ion hóa (Ion spray voltage – IS) từ 0 – 5500 V, điện thế bộ phận thu

+MS2 (304.00) CE (46): 36 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Vilda... Max. 7.9e6 cps.

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z, Da 0.0 5.0e5 1.0e6 1.5e6 2.0e6 2.5e6 3.0e6 3.5e6 4.0e6 4.5e6 5.0e6 5.5e6 6.0e6 6.5e6 7.0e6 7.5e6 7.9e6 Int ens it y, cp s 304.0 154.0 97.0 77.0 93.0 151.0 95.0 70.0 107.0 133.0 81.0 127.0

mẫu (Decluster potential) này từ 0 đến 300 V. Các thông số này được xác định từ giản đồ tối ưu điện thế trên Hình 3.3.

Hình 3.3. Giản đồ tối ưu điện thế bộ phận thu mẫu

Để giảm độ nhiễu của nền mẫu, tăng độ đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp phân tích, khối phổ 2 lần (MS/MS) được lựa chọn để sử dụng năng lượng phân mảnh ion mẹ tạo ra các mảnh ion con đặc trưng. Kết quả thực nghiệm cho thấy khi tiến hành phân mảnh ion mẹ (mảnh ion tiền thân), lựa chọn mảnh ion con cho tín hiệu đo cao và ổn định nhất, đồng thời có điện thế phân mảnh tối ưu thì xác định được các mảnh ion con phù hợp để định lượng chất phân tích là m/z 154,0 và m/z 97,0 tương ứng với điện thế phân mảnh lần lượt là 21 V và 39 V.

Như vậy các thơng số khối phổ cho các chất phân tích được lựa chọn và xác định như sau:

+ Điện thế ion hóa (IS): 5000 V

+ Điện thế bộ phận thu mẫu (DP): 142 V

+ Đo chọn lọc đa ion (MRM): 304,0 >> 154,0 >> 97,0 + Năng lượng phân mảnh: 21V, 39 V

3.1.1.2. Khảo sát lựa chọn chuẩn nội

Tiến hành khảo sát lựa chọn chuẩn nội trên các chất: Diltiazem, metoprolol, carbamazepin. Tiến hành tối ưu hóa điều kiện khối phổ của từng chất khảo sát tương tự như cách tiến hành với VDG. Khi sử dụng các thế phân mảnh khác nhau tạo ra các mảnh con tương ứng như sau: Diltiazem 178 Da (415 → 178); Metoprolol 116 Da (268,1 → 115,6); Carbamazepin 194 Da (237 → 194).

Hình 3.4. Sắc ký đồ mẫu huyết tương có chuẩn VDG, carbamazepin, metoprolol, diltiazem

Trên sắc ký đồ (Hình 3.4) của mẫu huyết tương có chứa VDG và các chất carbamazepin, metoprolol, diltiazem có nồng độ khoảng 2 ng cho thấy carbamazepin có hình dáng pic cân đối, thời gian lưu tương tự với VDG. Ngồi ra, carbamazepine có tính chất lý hóa tương tự như VDG nên điều kiện sắc ký và quy trình xử lý mẫu là tương tự nhau. Do vậy, carbamazepin (CTPT:

C15H12N2O; KLPT: 236.269 g/mol) được lựa chọn làm chất chuẩn nội.

XIC of +MRM (4 pairs): 304.000/154.000 Da ID: Vildagliptin from Sample 1 (Cot luna-chuan2ng-DIL-tua... Max. 3.3e4 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 Time, min 0.0 5.0e5 I... 0.82

XIC of +MRM (4 pairs): 237.000/194.000 Da ID: Carbamazepine from Sample 1 (Cot luna-chuan2ng-DIL... Max. 5.4e5 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 Time, min 0.0 5.0e5 I... 0.75

XIC of +MRM (4 pairs): 268.100/115.600 Da ID: Metoprolol from Sample 1 (Cot luna-chuan2ng-DIL-tua9... Max. 1.2e5 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 Time, min 0.00 1.00e5 I... 0.58

XIC of +MRM (4 pairs): 415.200/178.000 Da ID: Diltiazem from Sample 1 (Cot luna-chuan2ng-DIL-tua9) ... Max. 4.8e4 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 Time, min 0.0 4.8e4 I... 1.15

3.1.1.3. Tối ưu hóa các điều kiện khối phổ

Từ điều kiện sắc ký xác định được, tiến hành tối ưu các thơng số nguồn ion hóa bao gồm áp suất dịng khí hóa hơi dung mơi (GAS1 & GAS2), tốc độ dịng khí thổi làm sạch. Nhiệt độ hóa hơi dung mơi để tín hiệu đo thu được cao và ổn định nhất, hạn chế tối đa nhiễm bẩn thiết bị. Kết quả khảo sát thu được thơng số áp suất dịng khí hóa hơi dung mơi GAS1: 35psi; GAS2: 65psi; thơng số khí thổi làm sạch 100 psi; thơng số nhiệt độ hóa hơi dung mơi 65°C. Điều kiện nguồn ion hoá tối ưu được tổng kết trong Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Điều kiện nguồn ion hoá

Chế độ ion hóa ESI (+)

Điện thế ion hố (V) 5000

Khí phun sương (psi) 35

Khí tăng cường (psi) 65

Nhiệt độ hố hơi (°C) 65

Khí thổi (psi) 100

3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký

Khảo sát trên các cột Hypersil Gold C18 50 x 2,1 mm;, cột Hypersil Gold C8 50 x 2,1 mm; 1,9 µm, Cột Luna C18(2)-HST 50 x 3 mm; 2,5 µm nhận thấy cột Hypersil Gold C8 50 x 2,1 mm; 1,9 µm cho pic cân đối, tín hiệu đo của pic cao hơn. Do đó cột Hypersil Gold C8 50 x 2,1 mm; 1,9 µm được lựa chọn để cho các nghiên cứu khảo sát về sau.

Các hệ pha động khác nhau gồm MeOH:axit formic 0,1%, MeOH:amoni axetat 2 – 10 mM, MeOH:amoni bicacbonat 1 – 10 mM, MeCN:axit formic 0,1%, MeCN:amoni axetat 2 – 10 mM, MeCN:amoni bicacbonat 1 – 10 mM được lựa chọn khảo sát cho thấy hệ pha động MeCN:amoni axetat 2 mM,

MeCN:amoni bicacbonat 1 mM, với tỷ lệ MeCN từ 80 – 90% cho hình dáng pic, tín hiệu đo pic tốt nhất.

Khi thay đổi tỷ lệ của pha động gồm MeCN:amoni axetat (8:2), pic VDG có cường độ tín hiệu giảm và xuất hiện hơi nước ngưng tụ ở buồng ion hóa. Tuy nhiên, khi tăng tỷ lệ dung dịch MeCN:amoni axetat (9:1) pic của VDG có cường độ tín hiệu cao và ổn định, hình dáng pic cân đối hơn nhưng nền mẫu cao (1e3). Như vậy, khi sử dụng hệ pha động MeCN:amoni axetat, chất phân tích bị ảnh hưởng của nền mẫu, làm giảm tín hiệu đo.

Hình 3.5. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động MeCN:amoni axetat 2mM (8:2)

Hình 3.6. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động

XIC of +MRM (1 pair): 304.000/154.000 Da ID: Vildagliptin from Sample 1 (Ch... Max. 1.5e5 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 Time, min 0.0 1.0e4 2.0e4 3.0e4 4.0e4 5.0e4 6.0e4 7.0e4 8.0e4 9.0e4 1.0e5 1.1e5 1.2e5 1.3e5 1.4e5 1.5e5 Int ensit y, cps 1.03 0.05

XIC of +MRM (1 pair): 304.000/154.000 Da ID: Vildagliptin from Sample 1 (Ch... Max. 1.5e5 cps.

Với hỗn hợp pha động MeCN:amoni bicacbonat, khi thay đổi tỷ lệ thành phần pha động thì thời gian lưu, hình dáng pic, tín hiệu đo của VDG thay đổi theo nhưng chất phân tích ít bị ảnh hưởng nền mẫu hơn. Với tỷ lệ MeCN:amoni bicacbonat 1mM (95:5) xuất hiện pic VDG khá nhiễu, đuôi pic kéo dài; MeCN:amoni bicacbonat 1mM (90:10) và MeCN:amoni bicacbonat 2mM (80:20) pic của VDG xấu, nền mẫu cao. Ngược lại khi thành phần pha động MeCN:amoni bicacbonat 1mM (85:15) thì pic VDG cân đối và thời gian phân tích phù hợp. Do đó, tỷ lệ MeCN:amoni bicacbonat 1mM (85:15) được lựa chọn làm thành phần pha động tối ưu.

Hình 3.7. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động MeCN:amoni bicacbonat 1mM (95:5)

Hình 3.8. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động MeCN:amoni bicacbonat 1mM (90:10)

XIC of +MRM (1 pair): 304.000/154.000 Da ID: Vildagliptin from Sample 1 (... Max. 2.4e4 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 Time, min 0.0 2000.0 4000.0 6000.0 8000.0 1.0e4 1.2e4 1.4e4 1.6e4 1.8e4 2.0e4 2.2e4 2.4e4 Int ens ity, cp s 0.92

XIC of +MRM (1 pair): 304.000/154.000 Da ID: Vildagliptin from Sample 1 (... Max. 2.6e4 cps.

Hình 3.9. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động MeCN:amoni bicacbonat 2mM (85:15)

Hình 3.10. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động MeCN:amoni bicacbonat 2mM (80:20)

Thể tích tiêm mẫu và tốc độ dịng cũng ảnh hưởng tới pic và tín hiệu đo. Khi thể tích tiêm là 1µL pic của các chất cân đối, tín hiệu đo pic tại nồng độ thấp VDG và IS đạt yêu cầu. Với tốc độ dòng 0,4mL/phút, các pic VDG có hình dáng cân đối và thời gian phân tích ngắn, đồng thời tín hiệu pic VDG cao.

XIC of +MRM (1 pair): 304.000/154.000 Da ID: Vildagliptin from Sample 1... Max. 9407.0 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 Time, min 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 9407 Int ens it y, cp s 0.77 0.54 0.90 0.43

Từ kết quả thực nghiệm ở trên, điều kiện sắc ký để định lượng VDG và IS trên hệ thống LC-MS/MS được lựa chọn như sau:

• Cột Hypersil Gold C8 50 x 2,1 mm; 1,9 àm

ã Pha động MeCN: amoni bicacbonat 1mM (85: 15)

• Tốc độ dịng: 0,4 mL/phút

• Thể tích tiêm: 1µL

Như vậy, với hệ thống sắc ký lỏng siêu năng ở các điều kiện tối ưu ở trên, quy trình tách diễn ra tương đối nhanh và tiêu tốn ít dung mơi hóa chất, do đó ít gây ơ nhiễm mơi trường hơn so với các phương pháp HPLC định lượng VDG khác [8, 9, 11]. Hơn nữa, thời gian phân tích một mẫu khoảng 2 phút nên phương pháp LC-MS/MS đã góp phần giảm đáng kể tổng thời gian phân tích khi số lượng mẫu huyết tương nhiều, vì vậy sẽ rất phù hợp để áp dụng phân tích các mẫu trong các nghiên cứu sinh khả dụng (SKD) và tương đương sinh học (TĐSH) (Hình 3.11)

3.1.3. Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu huyết tương

Tiến hành chuẩn bị các mẫu huyết tương tự tạo chứa chuẩn VDG và IS. Xử lý các mẫu trắng và mẫu chuẩn theo bằng phương pháp kết tủa protein.

Sử dụng điều kiện sắc ký đã khảo sát, đánh giá quy trình xử lý mẫu ở trên với tỷ lệ dung môi khác nhau (1:3; 1:4; 1:10). Qua q trình phân tích mẫu thấy được xử lý mẫu với tỷ lệ dung môi 1:3 dung dịch sau ly tâm hơi vẩn đục, tỷ lệ 1:10 mẫu sạch nhưng mẫu bị pha lỗng nhiều ảnh hưởng tín hiệu đo pic. Vì vậy đã lựa chọn tỷ lệ 1:4 cho tín hiệu đo tốt, nền mẫu sạch.

So với kỹ thuật chiết SPE [11] để định lượng VDG, phương pháp xử lý mẫu này đơn giản, kinh tế và dễ thực hiện hơn.

So với phương pháp chiết LLE [5, 7] mẫu thu được bằng phương pháp kết tủa protein, tác nhân tạo kết tủa là MeCN, thời gian phân tích ngắn, đơn giản, dễ thực hiện, tiết kiệm chi phí.

Do vậy, quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp kết tủa protein được tối ưu hoá và thể hiện trên sơ đồ như sau:

Hình 3.12. Quy trình xử lý mẫu

250 µL mẫu huyết tương

Lắc xốy 10s Ly tâm 6500 vịng/phút x 5 phút Hút lớp dịch trong Tiêm sắc ký +25µL IS + 1mL MeCN

3.1.4. Xây dựng phương pháp định lượng VDG trong huyết tương

Từ các kết quả nêu trên, phương pháp LC-MS/MS định lượng VDG trong huyết tương người bao gồm xử lý mẫu bằng phương pháp kết tủa protein, sau đó phân tích định lượng bằng LC-MS/MS được xây dựng tối ưu như sau:

3.1.4.1. Quy trình xử lý mẫu huyết tương

Bảng 3.2 trình bày tổng hợp các điều kiện sắc ký áp dụng phân tích VDG và IS. Quy trình được tiến hành như sau: Hút 250 µL HT + 25 µL dung dịch IS làm việc. Sau đó, thêm 1 mL MeCN, lắc xốy 10 giây, rồi tiến hành ly tâm 6500 vòng/phút x 5 phút. Hút lấy lớp dịch nổi và tiến hành tiêm sắc ký.

Bảng 3.2. Điều kiện sắc ký Thông số Mô tả Thông số Mô tả Detector MS/MS QTrap 6500+ Cột sắc ký Hypersil Gold C8; 50 x 2,1 mm; 1,9 µm Bảo vệ cột C18; 4 x 3 mm Nhiệt độ cột 40°C

Pha động MeCN : Amoni bicacbonat 1 mM (85 : 15)

Tốc độ dịng 0,4 mL/phút

Thể tích tiêm 1 µL

Nhiệt độ autosampler Nhiệt độ phịng

3.1.4.2.Điều kiện khối phổ

Bảng 3.3 tổng hợp tóm tắt các thông số điều kiện của thiết bị phổ khối MS/MS, kiểu ion hóa ESI (+) với detector: Qtrap 6500+ để phân tích VDG và IS. Các thơng số của thiết bị khối phổ để định lượng VDG và IS trong huyết tương.

Bảng 3.3. Điều kiện khối phổ định lượng VDG và IS

Hoạt chất Thông số

Vildagliptin Carbamazepin (IS)

Chế độ ion hóa ESI (+) ESI (+)

Điện thế ion hoá (V) 5000 5000

Khí phun sương (psi) 35 35

Khí tăng cường (psi) 65 65

Nhiệt độ hoá hơi (°C) 65 65

Năng lượng thế chọn lọc ion (V) 500 500

Khí thổi (psi) 100 100

Năng lượng phân mảnh (V) 21 27

Điện thế đầu ra bộ phận phân mảnh (V) 20 20 Mảnh mẹ (parent ion) (m/z, Dalton) 304 237 Mảnh con (product ion) (m/z, Dalton) 154 194

Hình 3.13 cho thấy sắc ký đồ của mẫu huyết tương chứa VDG và IS khi thực hiện phân tách và phân tích khối phổ với các điều kiện tối ưu được thiết lập ở trên. Sắc ký đồ cho thấy sự tồn tại các pic của VDG, IS rõ ràng, phù hợp để phân tích định lượng.

Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu huyết tương chứa VDG và IS tại chế độ ESI (+)

3.1.5. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

3.1.5.1. Sự phù hợp của hệ thống LC-MS/MS

Chuẩn bị mẫu SST trong huyết tương theo quy trình phân tích để kiểm tra sự phù hợp của hệ thống. Xử lý mẫu theo quy trình phân tích đã xây dựng. Tiêm lặp lại 6 lần mẫu thu được sau xử lý. Ghi lại SKĐ và tín hiệu đo pic của 6 lần phân tích.

Hình 3.14. Sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng có pha IS và chuẩn VDG ở nồng độ 288 ng/mL

Bảng 3.4. Kết quả đánh giá sự phù hợp của hệ thống

STT

VDG IS

VDG/IS Diện tích pic tR (min) Diện tích pic tR (min)

1 12248565 0,494 8048427 0,478 1,522 2 12299777 0,496 7973970 0,479 1,542 3 12491302 0,495 8018237 0,477 1,558 4 12367001 0,496 7896209 0,479 1,566 5 12259423 0,495 7930986 0,479 1,546 6 12093378 0,495 7948610 0,478 1,521 TB 12293241 0,495 7969407 0,478 1,543 CV (%) 1,1 0,2 0,7 0,2 1,2

Trên sắc ký đồ của các mẫu huyết tương có pha thêm IS và chuẩn VDG, pic của VDG cân đối, được nhận diện rõ ràng, tách khỏi các pic tạp có trong mẫu. Giá trị diện tích của pic chất phân tích và tỷ lệ diện tích pic giữa VDG với IS tương ứng đều có độ lặp lại tốt (CV < 5%). Thời gian lưu (tR) của pic VDG có độ lặp lại cao (CV <1%). Như vậy hệ thống LS-MS/MS ổn định và phù hợp để định lượng VDG trong huyết tương.

3.1.5.2. Độ chọn lọc của phương pháp

Tiến hành chuẩn bị các mẫu:

Điều kiện khối phổ và lựa chọn chuẩn nội để định lượng Vildagliptin

Bộ phận phân tích khối

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU