Nghiên cứu được tiến hành thực hiện dựa trên việc tham khảo các tài liệu về định lượng VDG trong dịch sinh học [4, 8-13] với điều kiện trang thiết bị hiện có tại Trung tâm đánh giá tương đương sinh học (Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương).
2.3.1. Xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích trên hệ thống LC-MS/MS
2.3.1.1. Xây dựng điều kiện khối phổ xác định VDG và chuẩn nội
Sử dụng hệ thống LC-MS/MS, QTrap 6500+ với nguồn ion hóa kiểu ESI, tiến hành thực nghiệm như sau:
- Tối ưu hóa điều kiện khối phổ VDG:
Tiêm dung dịch chuẩn VDG nồng độ 200 ng/mL với tốc độ 5 µL/phút vào trong hệ thống khối phổ thông qua nguồn ion hóa ESI để xác định:
+ Ion mẹ cho VDG.
+ Tối ưu các điều kiện ở nguồn ion hóa và bộ phận thấu kính hội tụ ion để lượng ion mẹ đi vào bộ phận phân tích khối là nhiều và ổn định nhất.
+ Xác định mảnh ion con của VDG có cường độ tín hiệu cao và ổn định. + Tối ưu năng lượng phân mảnh ion mẹ thành ion con đã xác định ở trên để lượng ion con tạo thành nhiều và ổn định nhất.
- Khảo sát lựa chọn chuẩn nội:
Dựa trên cấu trúc phân tử và tính chất hóa lý của các chất để tiến hành lựa chọn chuẩn nội cho phương pháp. Chuẩn nội được lựa chọn phải đảm bảo bền vững, có thể tham gia quá trình chiết tách và phân tích sắc ký cùng chuẩn. Một số chất chuẩn nội được lựa chọn khảo sát bao gồm: diltiazem, metoprolol, carbamazepin. Tiến hành tối ưu hóa điều kiện khối phổ của chuẩn nội tương tự như với chất chuẩn VDG để thu được cường độ tín hiệu cao và ổn định.
2.3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký
Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa VDG và IS trong pha động có nồng độ khoảng 200 ng/mL. Tiến hành khảo sát với các điều kiện sắc ký khác nhau bao gồm: sử dụng cột Hypersil Gold C18 50 x 2,1 mm; 1,9 µm, cột Hypersil Gold C8 50 x 2,1 mm; 1,9 µm, Cột Luna C18(2)-HST 50 x 3 mm; 2,5 µm, cùng các hệ pha động khác nhau MeOH-dung dịch axit formic 0,1%, MeOH-dung dịch amoni axetat 2 – 10 mM, MeOH-dung dịch amoni bicacbonat 1 – 10 mM, MeCN-dung dịch axit formic 0,1%, MeCN-dung dịch amoni axetat 2 – 10 mM, MeCN-dung dịch amoni bicacbonat 1 – 10 mM theo các tỷ lệ khác nhau.
2.3.1.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương
Nguồn ion hóa ESI của thiết bị LC-MS/MS, với cơ chế nhiễm điện bề mặt thích hợp để ion hóa VDG. Quá trình ion hóa VDG ở nguồn ESI bị ảnh hưởng bởi các chất rửa giải trong dòng pha động sắc ký. Do vậy phương pháp xử lý mẫu huyết tương loại bỏ tạp chất, loại bỏ các tác nhân ảnh hưởng đến quá trình ion hóa VDG ở nguồn ESI và thu hồi các chất phân tích với tỷ lệ cao, lặp lại có vai trò quan trọng trong khi phân tích bằng LC-MS/MS.
Kỹ thuật xử lý mẫu huyết tương có 3 phương pháp chính: Kết tủa protein (PPT), chiết lỏng – lỏng (LLE), chiết pha rắn (SPE). Do VDG và IS là những chất thân dầu (Log P > 0), trong khi đó yêu cầu về độ nhạy với VDG khá cao (3 ng/mL). Vì vậy trong nghiên cứu này, phương pháp kết tủa protein được lựa chọn áp dụng do có ưu điểm thực hiện nhanh, đơn giản và chi phí thấp với các tác nhân tủa là các axit hữu cơ như: axit percloric, TCA…hoặc các dung môi hữu cơ như: MeOH, MeCN…
Các axit hữu cơ có khả năng tủa mạnh, thể tích cần dùng nhỏ nên ít làm pha loãng mẫu. Tuy vậy, mẫu sau xử lý có chứa lượng lớn axit của Clo nên không phù hợp cho thiết bị khối phổ, có thể gây ăn mòn các bộ phận thiết bị. Ngoài ra, nồng độ các phospholipid không được pha loãng nên gây ra ảnh hưởng nền mẫu nhiều khi phân tích khối phổ. Với tác nhân kết tủa là dung môi hữu cơ như MeOH và MeCN, tỷ lệ sử dụng là 1/3 hoặc nhiều dung môi hơn,
lượng protein bị loại bỏ > 99%, mẫu sẽ bị pha loãng nhiều; tuy nhiên, nồng độ phospholipid sẽ bị pha loãng nên giảm ảnh hưởng nền mẫu, mẫu sau xử lý tương thích với thiết bị khối phổ. Phương pháp xử lý mẫu được nghiên cứu đã sử dụng tác nhân tạo kết tủa MeCN. Sau khi mẫu huyết tương được tạo kết tủa với MeCN, MeCN gây kết tủa protein mạnh hơn, mẫu sau kết tủa dễ dàng ly tâm lấy dịch trong hơn khi kết tủa bằng MeOH. Vì vậy, MeCN được lựa chọn làm tác nhân kết tủa protein trong nghiên cứu này.
Tiến hành khảo sát các phương pháp xử lý mẫu trên mẫu HTT và các mẫu tự tạo chứa chuẩn VDG với nồng độ thích hợp (không qua chiết tách) để so sánh tín hiệu đo của pic với các mẫu có nồng độ tương ứng trong huyết tương.
Từ kết quả khảo sát, lựa chọn phương pháp xử lý mẫu đơn giản, hiệu quả có thể chiết tách VDG với độ thu hồi cao, ổn định và không gây ra ảnh hưởng của nền mẫu khi phân tích bằng MS, đồng thời đảm bảo độ ổn định của chất phân tích trong suốt quá trình xử lý.
2.3.1.4. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích
Tiến hành xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định lượng VDG trong HT người bằng kỹ thuật LC-MS/MS theo quy định của US-FDA [30, 31] và EMA (2012) [32] về xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích trong dịch sinh học. Các chỉ tiêu cần xác nhận giá trị sử dụng bao gồm: độ đặc hiệu – chọn lọc của phương pháp; giới hạn định lượng dưới; đường chuẩn – khoảng tuyến tính; ảnh hưởng của nền mẫu; độ nhiễm chéo; độ đúng – độ chính xác trong ngày; độ đúng – độ chính xác khác ngày; tỉ lệ thu hồi; độ mở rộng batch; độ đúng – độ chính xác khi tiêm lại; độ ổn định auto sampler… và độ ổn định của hoạt chất trong quá trình xử lý.
- Chuẩn bị mẫu chuẩn:
Các dung dịch chuẩn trong dung môi trong dung môi được chuẩn bị như sau:
+ Dung dịch chuẩn gốc để pha đường chuẩn (CCA): Cân chính xác lượng chất chuẩn vildagliptin, hòa tan trong methanol để thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ vildagliptin khoảng 240 µg/mL.
+ Dung dịch chuẩn gốc để pha mẫu kiểm tra (QCA): Cân chính xác lượng chất chuẩn vildagliptin, hòa tan trong methanol để thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ vildagliptin khoảng 240 µg/mL.
+ Dung dịch chuẩn gốc làm việc (CCB, QCB): Từ dung dịch chuẩn gốc CCA, QCA, tiến hành pha loãng trong methanol – nước (1:1) để thu được dung dịch chuẩn làm việc CCB, QCB có nồng độ vildagliptin khoảng 24 µg/mL.
+ Dung dịch chuẩn nội gốc: Cân chính xác khoảng 25 mg chất nội chuẩn, hòa tan trong methanol thu được dung dịch chuẩn nội gốc có nồng độ khoảng 500 µg/mL.
+ Dung dịch chuẩn nội làm việc: Từ dung dịch chuẩn nội gốc, tiến hành pha loãng trong methanol – nước (1:1) để thu được dung dịch chuẩn nội làm việc có nồng độ khoảng 2,5 µg/mL.
- Cách chuẩn bị dung dịch xây dựng đường chuẩn và mẫu LLOQ trong huyết tương
+ Từ dung dịch CCB, pha dung dịch chuẩn làm việc trong huyết tương WSS-CC1 và WSS-CC2 có nồng độ VDG tương ứng khoảng 600 ng/mL và 30 ng/mL.
+ Mỗi đường chuẩn (CC) bao gồm: 01 mẫu huyết tương trắng (blank), 01 mẫu huyết tương trắng có pha IS (zero) và 08 mẫu huyết tương có pha chuẩn VDG và IS.
+ Nồng độ và cách chuẩn bị các mẫu của đường chuẩn (CC) và mẫu giới hạn định lượng dưới (LLOQ) trong huyết tương được trình bày ở
Bảng 2.2. Cách chuẩn bị đường chuẩn trong huyết tương
Mẫu Blank Zero S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8
Nồng độ (ng/mL) 3 6 15 30 60 180 420 600 Vhuyết tương trắng (µL) 250 250 225 200 125 0 225 175 75 0 VWSS-CC1 (µL) - - - - 25 75 175 250 VWSS-CC2 (µL) 25 50 125 250 - - - -
Bảng 2.3. Cách chuẩn bị mẫu LLOQ trong huyết tương
Mẫu Nồng độ (ng/mL) Vhuyết tương trắng (µL) VWSS-CC2 (µL)
LLOQ 3 225 25
- Xây dựng đường chuẩn
- Tiến hành pha các mẫu huyết tương chứa chuẩn VDG với 8 mẫu chuẩn trong huyết tương.
- Chuẩn bị 05 đường chuẩn riêng biệt chứa VDG ở khoảng nồng độ như trên. Xử lý và phân tích theo quy trình xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp. Ghi lại sắc ký đồ và tín hiệu đo pic.
- Khảo sát trên các mô hình weighting: 1, 1/x, 1/x2, 1/x1/2 để lựa chọn mô hình phù hợp nhất.
Từ dữ liệu thực nghiệm, xác định được hệ số tỷ trọng (1/x2) và xây dựng đồ thị phần dư của các đường chuẩn thực nghiệm theo mô hình weighting 1/x2.
- Chuẩn bị các mẫu kiểm tra trong huyết tương:
Mẫu kiểm tra được chuẩn bị từ dung dịch gốc độc lập với mẫu chuẩn. Tiến hành tương tự như mẫu chuẩn làm việc WSS-CC1 và WSS-CC2 để thu được dung dịch WSS-QC1 và WSS-QC2 có nồng độ VDG trong huyết tương lần lượt là 600 ng/mL và 30 ng/mL.
Từ dung dịch chuẩn làm việc WSS-QC1 và WSS-QC2, phối hợp với HTT theo
Bảng 2.4 để được các mẫu kiểm tra LQC, MQC, HQC có nồng độ dự kiến (LQC có nồng độ VDG bằng khoảng 3 lần nồng độ thấp nhất của đường chuẩn – LLOQ; MQC có nồng độ VDG bằng khoảng 30 – 50% nồng độ cao nhất của đường chuẩn – ULOQ; HQC có nồng độ VDG bằng khoảng 75 – 90% ULOQ).
Bảng 2.4. Cách chuẩn bị mẫu QC trong huyết tương
Mẫu Nồng độ (ng/mL) VWSS-QC1 (µL) VWSS-QC2 (µL) VHTT (µL)
LQC 9 - 75 175
MQC 240 100 - 150
HQC 480 200 - 50
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn nội:
Cân chính xác khoảng 25 mg chất nội chuẩn vào bình định mức 50 mL, hòa tan trong methanol để thu được dung dịch chuẩn nội gốc có nồng độ khoảng 500 µg/mL.
Từ dung dịch chuẩn nội gốc, tiến hành pha loãng trong nước để thu được dung dịch chuẩn nội làm việc có nồng độ thích hợp (tín hiệu đo của chuẩn nội bằng khoảng 50% tín hiệu đo của VDG ở nồng độ ULOQ).
2.3.1.5. Phương pháp tính kết quả
- Xác định nồng độ VDG có trong các mẫu thử chưa biết nồng độ dựa vào tỷ lệ diện tích pic VDG/IS thu được từ sắc đồ của mẫu thử và đường chuẩn tương ứng phân tích trong cùng điều kiện.
➢ Đường chuẩn Y = aX + b (phương pháp bình phương tối thiểu) Trong đó:
+ Y: tỷ lệ diện tích pic VDG/IS + a: độ nhạy
+ X: nồng độ VDG + b: sai số hệ thống
➢ Nồng độ định lượng được: X = (Y - b)/a
- Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của nồng độ định lượng được với nồng độ pha thực tế của mẫu và được xác định theo công thức:
Độ đúng (%) = Nồng độ định lượng được
Nồng độ pha thực tế × 100
- Độ chính xác là giá trị phản ánh mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất, được biểu thị bằng giá trị CV (%):
CV (%) = S
XTB × 100 Trong đó:
S: độ lệch chuẩn giữa giá trị các lần định lượng XTB: giá trị trung bình của các lần định lượng - Hệ số (MF) đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu:
MFVDGhoặcMFIS =A B Trong đó:
A: tín hiệu đo của pic của VDG hoặc IS của mẫu pha trong nền mẫu B: tín hiệu đo trung bình pic của VDG hoặc IS mẫu pha trong pha động - Độ thu hồi (TLTH) được xác định bằng cách so sánh tín hiệu đo pic của chuẩn/chuẩn nội trong các mẫu QC có qua chiết tách (mẫu huyết tương)
với tín hiệu đo pic của chuẩn/ chuẩn nội trong các mẫu chuẩn tương ứng không qua chiết tách, được pha trong nền mẫu (mẫu so sánh):
TLTH (%)= Tín hiệu đo pic trong mẫu HT
Tín hiệu đo pic trong mẫu so sánh×H×100 Trong đó, H: là hệ số hiệu chỉnh
- So sánh tín hiệu đo của mẫu nghiên cứu độ ổn định bảo quản ở các điều kiện khác nhau với tín hiệu đo mẫu mới pha:
+ Mẫu trong huyết tương:
% Độ ổn định=Trung bình nồng độ mẫu độ ổn định
Nồng độ pha thực tế ×100 + Dung dịch chuẩn:
% Độ ổn định=Trung bình tín hiệu đo mẫu độ ổn định × Nồng độ mẫu mới pha Trung bình tín hiệu đo mẫu mới pha × Nồng độ mẫu độ ổn định×100
2.3.2. Xác định nồng độ VDG trong mẫu huyết tương người tình nguyện
Áp dụng phương pháp LC-MS/MS đã xây dựng xác định nồng độ VDG trong huyết tương người tình nguyện (NTN) tham gia nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học chế phẩm vildagliptin hàm lượng 50 mg. Đề cương nghiên cứu đã được Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương phê duyệt. Thiết kế nghiên cứu là nghiên cứu chéo, ngẫu nhiên, nhãn mở, đơn liều, 2 thuốc, 2 trình tự, 2 giai đoạn.
Người tình nguyện là nam hoặc nữ giới khỏe mạnh, tuổi 18 – 45, có chỉ số BMI về cân nặng và chiều cao phải trong khoảng từ 18 – 30 kg/m2 theo cách tính của Metropolitan Index 1983 cho người lớn, được kiểm tra lâm sàng và làm các xét nghiệm cơ bản (xét nghiệm máu, sàng lọc kháng thể HIV, kháng nguyên viêm gan B, xét nghiệm nước tiểu), xem xét tiền sử bệnh, có khả năng hiểu các thông tin về nghiên cứu [19, 30, 33, 34].
- NTN được uống 01 viên nén chứa VDG 50 mg trong tình trạng nhịn ăn ít nhất 10 giờ. Lấy mẫu từ tĩnh mạch cẳng tay NTN ở các thời điểm: trong vòng
1,5 giờ trước khi uống thuốc (thời điểm 0 giờ) và sau khi uống thuốc các khoảng thời gian: ); 0,25; 0,50; 0,75; 1,00; 1,33; 1,67; 2,00; 2,50; 3,00; 4,00; 6,00; 8,00; 12,00; 15,00 và 24,00 giờ. + Các mẫu từ 0,25 – 2 giờ: ± 1 phút; + Các mẫu 2,5 – 3 giờ: ± 2 phút; + Mẫu 4 giờ: ± 3 phút. + Các mẫu 4 – 8 giờ: ± 6 phút; + Các mẫu 12 – 15 giờ: ± 9 phút. + Mẫu 24 giờ: ± 25 phút.
Với các điểm lấy mẫu chênh lệch quá thời gian quy định, thời gian lấy mẫu thực tế sẽ được ghi chép lại và sử dụng khi tính thống kê.
Cách lấy mẫu:
- Điểm 0 giờ: Lấy khoảng 5 mL máu qua kim luồn đặt cố định ở cánh tay NTN.
- Các điểm 0,25 giờ – 12 giờ: Lấy khoảng 5 mL máu qua kim luồn sau khi đã loại bỏ khoảng 0,5 mL máu chứa dung dịch chống đông (dung dịch NaCl 0,9% chứa Heparin 5 UI/mL).
- Với điểm 24 giờ và khi gặp sự cố tắc kim luồn: Lấy khoảng 5 mL máu trực tiếp từ tĩnh mạch cánh tay.
Thể tích máu:
Mỗi NTN hoàn thành nghiên cứu sẽ lấy tất cả khoảng 179 mL máu, gồm: - Khoảng 5 mL máu trong ngày tuyển chọn để xét nghiệm sàng lọc. - Khoảng 14 mL máu loại bỏ do chứa dung dịch chống đông ở các điểm từ 0,25 giờ – 15 giờ (14 điểm x 2 GĐ x 0,5 mL = 14 mL).
- Khoảng 160 mL máu cho các điểm từ 0 giờ – 24 giờ (16 điểm x 2 GĐ x 5 mL = 160 mL).
Mẫu máu sau khi lấy được cho vào ống có ghi nhãn chứa chất chống đông EDTA. Lắc ống bằng cách lật ngược ống 3 – 4 lần ngay sau khi cho máu vào. Ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút, ở 0 – 2°C. Tách lớp huyết tương cho vào các ống polyethylen có dán nhãn, kiềm hoá bằng NH4OH 2,5M (20 µL/mL huyết tương), trộn đều sau đó bảo quản ngay ở -70°C cho đến khi phân tích. Nhãn trên ống đựng máu và ống đựng huyết tương ghi các thông tin: mã số NTN, số nghiên cứu, giai đoạn, thời điểm lấy mẫu.
- Định lượng VDG trong các mẫu huyết tương NTN sau khi kết thúc lấy mẫu bằng phương pháp phân tích đã được xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng, thời gian từ khi lấy mẫu đầu tiên đến khi kết thúc quá trình phân tích nằm trong khoảng thời gian độ ổn định của mẫu huyết tương. Các mẫu huyết tương của cùng 1 NTN được phân tích trong cùng 1 ngày ở cùng điều kiện.