Các nghiên cứu về phân tích thuốc trong dịch sinh học phải tuân thủ các quy định theo tiêu chuẩn Thực hành tốt phòng thí nghiệm (GLP), Kế hoạch quản lý chất lượng (GCP) và phải đảm bảo về vấn đề đạo đức khi tiến hành. Nghiên cứu chỉ được bắt đầu khi có sự chấp thuận của Hội đồng đạo đức.
Phương pháp định lượng hoạt chất và chất chuyển hóa trong dịch sinh học đóng một vai trò quan trọng, quyết định đến khả năng thành công của các nghiên cứu. Tuy nhiên, có nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến độ đặc hiệu chọn lọc và độ nhạy của phương pháp như: khoảng nồng độ biến thiên rộng, nồng độ hoạt chất thấp có thể đến cỡ ng/mL, nền mẫu phức tạp (thường chứa muối, lipid, protein…).
Vì vậy, khi tiến hành xây dựng phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học cần chú trọng ba vấn đề cơ bản: kỹ thuật xử lý mẫu, điều kiện phân tích và cách tiến hành xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích nhằm đảm bảo độ tin cậy của phương pháp [20].
1.3.1. Kỹ thuật xử lý mẫu
Các mẫu dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu…) thường chứa một tỷ lệ lớn các protein làm cản trở khả năng phát hiện và định lượng dược chất. Vì vậy, mẫu phải được xử lý để loại tạp chất và có thể làm giàu mẫu trước khi tiến hành phân tích. Hiện nay, để xử lý mẫu huyết tương người ta hay áp dụng
ba kỹ thuật cơ bản sau: kết tủa protein, chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn [15, 21]. Ngoài ra, trong một số trường hợp, có thể sử dụng đồng thời hai hoặc cả ba kỹ thuật xử lý mẫu cơ bản đã nêu để tăng độ thu hồi hoạt chất cũng như loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu.
1.3.1.1. Kỹ thuật kết kết tủa protein (PPT)
Nguyên tắc của kỹ thuật này là sử dụng tác nhân gây kết tủa để loại đi phần lớn lượng protein có trong nền mẫu. Tác nhân gây kết tủa protein trong dịch sinh học thường dùng là axit hữu cơ (như acid tricloroacetic, acid percloric…), dung môi hữu cơ (như methanol, acetonitril…), muối vô cơ (như (NH4)2SO4, NaCl…) [22-26].
Kỹ thuật kết kết tủa protein có ưu điểm nhanh, đơn giản, dễ thực hiện, sử dụng lượng dung môi ít, các dung môi ít ảnh hưởng tới môi trường, có thể dễ dàng triển khai áp dụng tự động hóa để nâng cao năng suất và vì vậy là phương pháp kinh tế. Trên thực tế, để xử lý mẫu huyết tương dùng cho phân tích định lượng, người ta hay dùng kỹ thuật kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ hoặc axit.
Nhược điểm của kỹ thuật này là mẫu bị pha loãng khi tủa bằng dung môi hữu cơ, mẫu được xử lý chủ yếu chỉ loại được thành phần protein, các thành phần hòa tan khác (muối, phospholipid) vẫn được giữ lại, do đó có thể làm giảm tuổi thọ của cột sắc ký, gây nhiễu đường nền và hiệu ứng nền mẫu, ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả khi phân tích bằng các phương pháp sắc ký, đặc biệt là phương pháp sắc ký lỏng khối phổ.
1.3.1.2. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng (LLE)
Nguyên lý của kỹ thuật này là chuyển chất phân tích được hoà tan trong dung môi này sang dung môi khác không đồng tan. Tỉ lệ thu hồi hoạt chất phụ thuộc vào độ tan của hoạt chất trong dung môi chiết, tính phân cực của dung môi chiết, pH của pha nước, hệ số/hằng số phân bố của hoạt chất trong hai pha lỏng không trộn lẫn với nhau.
Trong thực nghiệm, các dung môi hay được lựa chọn là dietyleter, tert- butyl methyl eter, cloroform, dicloromethan, n-hexan... Các dung môi này có
thể dùng đơn thành phần hoặc dùng phối hợp với tỷ lệ thích hợp tuỳ theo từng hoạt chất phân tích.
Ưu điểm của kỹ thuật chiết lỏng – lỏng là mẫu thu được thu được tương đối sạch và có thể làm giàu mẫu, áp dụng được với nhiều dược chất có hệ số logP > 0, phù hợp với điều kiện và thiết bị của nhiều phòng thí nghiệm. Nhược điểm của kỹ thuật này sử dụng nhiều dung môi ảnh hưởng tới sức khỏe người phân tích và môi trường, trải qua nhiều bước, thời gian xử lý mẫu dài hơn so với kỹ thuật kết tủa protein, có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất chiết như hình thành nhũ tương, cân bằng pha, pH... từ đó ảnh hưởng đến kết quả phân tích và khó áp dụng tự động hóa [20, 27].
1.3.1.3. Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE)
Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) được phát triển dựa trên nguyên tắc của các kỹ thuật tách sắc ký (chất phân tích được lưu giữ trên cột và sau đó được rửa giải nhờ một hệ dung môi thích hợp). Các giai đoạn chính của kỹ thuật SPE gồm các giai đoạn: hoạt hóa cột, nạp mẫu, rửa và rửa giải. Ưu điểm của kỹ thuật này là nền mẫu sạch, tỷ lệ thu hồi cao, độ lặp lại tốt, có thể áp dụng với hầu hết các chất phân tích bằng việc lựa chọn cột chiết và dung môi rửa giải phù hợp, có thể dễ dàng áp dụng tự động hóa để nâng cao năng suất. Nhược điểm của kỹ thuật này chủ yếu đến từ chi phí cao của cột chiết pha rắn nên chưa phổ biến trong các phòng thí nghiệm của Việt Nam, ngoài ra việc lựa chọn quy trình phù hợp đòi hỏi cán bộ phân tích phải được đào tạo và có kĩ năng tốt, thời gian xử lý mẫu tương đối dài so với kỹ thuật kết tủa protein [20, 27].
Ngoài ba kỹ thuật xử lý mẫu cơ bản ở trên, còn có một số kỹ thuật khác được áp dụng trong xử lý mẫu dịch sinh học. Có thể kết hợp kỹ thuật kết tủa protein sau đó sử dụng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng, chiết pha rắn để làm sạch mẫu, kỹ thuật chiết lỏng lỏng giữa hai dung môi đồng tan có sử dụng nồng độ muối cao (Salting-out assisted liquid – liquid extraction – SALLE) [26, 28, 29], kỹ thuật kết tủa protein kết hợp sử dụng chất hấp thụ phospholipid để giảm ảnh hưởng của nền mẫu.
1.3.2. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học
Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định lượng dược chất trong dịch sinh học nhằm mục đích là chứng minh phương pháp có đủ độ đặc hiệu, độ nhạy, độ tin cậy và lặp lại để phân tích các mẫu thực.
Hiện nay ở Việt Nam, xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học được tiến hành theo US-FDA [30, 31], EMA [32]… gồm những chỉ tiêu sau:
1.3.2.1. Độ chọn lọc
Độ chọn lọc là khả năng nhận diện và phân biệt rõ ràng chất phân tích với các thành phần khác có trong mẫu. Tiến hành phân tích trên 06 mẫu huyết tương trắng (HTT) có nguồn gốc khác nhau và 06 mẫu tự tạo có chứa chuẩn nội và chất phân tích ở nồng độ thấp nhất của đường chuẩn (nồng độ LLOQ dự kiến) trong từng nền HTT tương ứng. Ghi lại sắc đồ, tín hiệu đo của pic và các thông số pic của các mẫu trắng và mẫu chuẩn.
Phương pháp LC-MS/MS được coi là chọn lọc đối với chất phân tích và chuẩn nội (IS) khi:
- Trên SKĐ mẫu chuẩn, các pic của chất phân tích và IS phải được nhận diện rõ ràng.
- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, tín hiệu đo của pic của từng mẫu trắng và mẫu Zero phải không được lớn hơn 20% tín hiệu đo của pic của mẫu LLOQ tương ứng.
- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, tín hiệu đo của pic của từng mẫu trắng phải không lớn hơn 5% tín hiệu đo trung bình của mẫu đường chuẩn (CC), QC và LLOQ.
1.3.2.2. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
Tiến hành phân tích trên 06 mẫu HTT, 06 mẫu tự tạo có chứa IS và chất phân tích ở nồng độ LLOQ dự kiến. Ghi lại sắc đồ và so sánh tỷ lệ tín hiệu đo của pic mẫu trắng và mẫu chuẩn.
Mẫu tự tạo được coi là LLOQ khi:
- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, tín hiệu đo trung bình mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần tín hiệu đo của mẫu Zero.
- Độ đúng trung bình từng lô và độ đúng trung bình của ít nhất 3 lô phải đạt từ 80% – 120% so với nồng độ thực.
- Độ chính xác của từng lô và của ít nhất 3 lô phải ≤ 20%.
1.3.2.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa tín hiệu đo của thiết bị và nồng độ của chất phân tích có trong mẫu.
Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ của chất phân tích, trong đó có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích với tỷ lệ tín hiệu đo của pic AN/IS.
Đường chuẩn phải có tối thiểu 6 giá trị nồng độ, bao phủ toàn bộ khoảng tuyến tính, có hệ số tương quan r ≥ 0,98 và phải đáp ứng các điều kiện sau:
- Độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ phải từ 85 – 115%, trừ tại điểm LLOQ được chấp nhận 80 – 120%.
- Có ít nhất 75% và 6 điểm chuẩn trong số điểm trong dãy chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, trong đó LLOQ và nồng độ cao nhất phải đạt tiêu chuẩn.
- Khoảng tuyến tính: có hệ số r ≥ 0,95.
1.3.2.4. Ảnh hưởng của nền mẫu
Tiến hành xử lý mẫu theo phương pháp đã xây dựng trên 6 mẫu HTT có nguồn gốc khác nhau thu được dung dịch nền mẫu. Thêm chuẩn nội và chất phân tích ở nồng độ LQC và HQC vào từng dung dịch nền mẫu trên. Song song chuẩn bị các mẫu chuẩn trong pha động chứa chuẩn nội và chất phân tích ở nồng độ tương ứng với nồng độ của các mẫu chuẩn trong nền mẫu. Phân tích sắc ký các mẫu trên. Xác định giá trị MFAN, MFIS của AN và IS bằng cách so sánh diện tích pic AN và IS giữa các mẫu pha trong nền mẫu với các mẫu pha trong pha động.
biến thiên (CV) của tỷ số MFAN/MFIS trên ít nhất 6 nền mẫu trắng có nguồn gốc khác nhau phải ≤ 15%.
1.3.2.5. Độ nhiễm chéo
Tiến hành xử lý mẫu theo phương pháp đã xây dựng trên 6 mẫu HTT, 6 mẫu chuẩn pha trong huyết tương (HT) ở nồng độ LLOQ và 6 mẫu chuẩn pha trong HT ở nồng độ cao nhất của đường chuẩn.
Mẫu được coi là không bị nhiễm chéo trong quá trình tiêm mẫu khi tiêm mẫu trắng ngay sau mẫu có nồng độ cao nhất của đường chuẩn thì tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, tín hiệu đo của pic trung bình của mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần tín hiệu đo của pic của từng mẫu trắng, tại thời gian lưu của IS phải gấp ít nhất 20 lần.
1.3.2.6. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày
Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của nồng độ chất phân tích định lượng được so với nồng độ lý thuyết.
Độ chính xác phản ánh độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất, được biểu thị bằng giá trị CV (%). Độ chính xác bao gồm độ chính xác trong ngày và độ chính xác khác ngày.
Độ đúng và độ chính xác được thực hiện trên 04 mức nồng độ khác nhau (LLOQ, LQC, MQC, HQC), mỗi nồng độ tiến hành ít nhất 5 mẫu.
Độ đúng trong ngày và khác ngày phải đạt trong khoảng 85 – 115%; độ chính xác trong ngày và giữa các ngày với giá trị CV ≤ 15%. Riêng nồng độ LLOQ cho phép độ đúng nằm trong khoảng 80 – 120% và giá trị CV ≤ 20%.
1.3.2.7. Độ thu hồi
Độ thu hồi là chỉ tiêu đánh giá khả năng tìm lại của chất phân tích và chuẩn nội sau quá trình chiết tách xử lý mẫu. Độ thu hồi được xác định bằng cách so sánh kết quả tín hiệu đo của các mẫu QC có qua chiết tách với tín hiệu đo của các mẫu chuẩn không được xử lý qua chiết tách (mẫu pha trong pha động).
Độ thu hồi của chất phân tích và chuẩn nội phải ổn định và độ thu hồi của chất phân tích tại các mức nồng độ khác nhau không được quá 15%.
1.3.2.8. Độ ổn định của hoạt chất trong dịch sinh học
Trong các nghiên cứu SKD, TĐSH… quá trình phân tích thường kéo dài vì số lượng mẫu lớn. Vì vậy, cần tiến hành nghiên cứu độ ổn định hoạt chất sau các quá trình bảo quản và phân tích. Hoạt chất phải ổn định trong quá trình xử lý, phân tích và bảo quản mẫu đông lạnh với thời gian phù hợp đủ để phân tích toàn bộ số mẫu huyết tương.
Trong xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp cần đánh giá các loại độ ổn định sau:
- Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc, dung dịch chuẩn làm việc thời gian dài và/hoặc thời gian ngắn.
- Độ ổn định của mẫu huyết tương bao gồm:
+ Độ ổn định sau 6 chu kỳ để đông đá – rã đông (đông – rã). + Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng.
+ Độ ổn định thời gian dài ở nhiệt độ bảo quản. + Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong autosampler).
Các mẫu huyết tương được coi là ổn định ở điều kiện nghiên cứu nếu các nồng độ trong mẫu độ ổn định sai khác so với nồng độ lý thuyết đều nhỏ hơn 15%.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Phương pháp nghiên cứu tiến hành trên các mẫu HT bao gồm: mẫu HT trắng, mẫu HT tự tạo chứa chuẩn VDG và mẫu HT của người tình nguyện (NTN) đã được uống 01 viên nén bao phim USABETIC®-VG 50 (vildagliptin 50 mg) được sản xuất bởi: Công ty CPDP AMPHARCO U.S.A, địa chỉ: KCN Nhơn Trạch 3, xã Hiệp Phước, huyện Nhơn Trạch, tỉnh Đồng Nai.
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.2.1. Hoá chất, chất chuẩn
Các chất chuẩn phục vụ cho nghiên cứu được tổng hợp trình bày trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các chất chuẩn được sử dụng
Tên
Mục đích sử dụng
Nơi sản xuất Số kiểm soát
Hàm lượng (%)
Vildagliptin Chuẩn TRC, Canada 1-MLM-173-1
99,19 (nguyên
trạng)
Carbamazepin Chuẩn nội VKNTTW WS.0115318.01
99,78 (nguyên
trạng) Diltiazem Chuẩn nội VKNTTW WS. 0108218
99,9% (chất khan)
Metoprolol Chuẩn nội VKNTTW WS. 0107228
100% (nguyên
2.2.2. Mẫu huyết tương trắng
- Huyết tương trắng được cung cấp bởi Bệnh viện Trung ương quân đội 108 gồm các lô: N1533; N1544; N1574; N1572; N1559; N1578; 19.01299; 19.01303 được bảo quản ở nhiệt độ -35°C.
- HTT sử dụng trong quá trình xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp được chuẩn bị như sau: thêm 2 mL dung dịch NH4OH 2,5 M vào 100 mL mẫu huyết tương trắng, trộn đều.
2.2.3. Dung môi, hoá chất
- Acetonitril; axit formic, nước loại ion đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho HPLC và LC – MS.
- Các dung môi, hóa chất khác như: Methanol; amoni bicacbonat; amino acetat… đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho phân tích
2.2.4. Dụng cụ, thiết bị
- Thiết bị phân tích chính là hệ thống sắc ký lỏng khối phổ của hãng Sciex (Mỹ) với detector QTrap 6500+, lắp đặt tại Trung tâm Đánh giá Tương đương sinh học – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương.
- Cân phân tích Mettler Toledo (d=0,01 mg). - Máy ly tâm lạnh Sigma 4-16KS.
- Máy lắc xoáy (vortex) Benchmark, USA. - Tủ lạnh sâu -70°C Panasonic, Nhật Bản.
- Micropipet Eppendorf: 0,5 – 10 µL; 10 – 100 µL; 100 – 1000 µL; 500 – 5000 µL.
- Cột sắc ký: Hypersil Gold C8; 50*2,1 mm; 1,9 µm.
- Bình định mức, bình thủy tinh class A: Prolabo-Pháp; Ống falcon 15 mL.
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu được tiến hành thực hiện dựa trên việc tham khảo các tài liệu về định lượng VDG trong dịch sinh học [4, 8-13] với điều kiện trang thiết bị hiện có tại Trung tâm đánh giá tương đương sinh học (Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương).
2.3.1. Xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích trên hệ thống LC-MS/MS
2.3.1.1. Xây dựng điều kiện khối phổ xác định VDG và chuẩn nội