Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.6. Kĩ thuật tách dòng gen
- Nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng
Sản phẩm PCR thu nhận được sau khi tinh sạch được gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT. Thành phần của phản ứng gắn gen vào vector như sau:
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nối gen IFS2 vào vector pBTSTT Thành phần Thể tích (µl) STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O 2 2 Buffer T4 ligase (10X) 1 3 Enzyme nối 1 4 Vector Pbt 1 5 Gen IFS2 5 Tổng 10
Hỗn hợp trên được ủ ở nhiệt độ 22oC trong 1,5 giờ và sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến chủng E. coli DH5α.
Hình 2.1. Cấu trúc vector pBT
- Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủngE. coli DH5α
Tế bào khả biến được lấy từ -80oC, làm tan dần trong đá trong khoảng 30 phút. Lấy 5µl sản phẩm của phản ứng ghép nối gen cho vào ống tế bào khả biến (50µl), đảo nhẹ nhàng để DNA phân bố đều trong dịch tế bào khả biến. Sau đó để sản phẩm plasmid tái tổ hợp trong đá 10 phút. Sốc nhiệt
bằng cách chuyển mẫu vào bể ổn nhiệt với nhiệt độ là 42ºC và ủ trong 90 giây. Lấy mẫu ra rồi đặt ngay vào đá trong 10 phút. Bổ sung 300µl LB lỏng để nuôi lắc 200 vòng/ phút ở 37oC trong 1 giờ. Ly tâm 5000 vòng ở 25ºC trong 5 phút, loại bỏ gần hết dịch nổi, chỉ để lại khoảng 100µl dịch, trộn đều sinh khối lắng để thành dạng huyền phù tế bào. Hút 100µl dịch tế bào và cấy trải trên đĩa môi trường LB đặc bổ sung ampicillin 50mg/l, X-gal, IPTG. Nuôi qua đêm ở 37ºC.
- Kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng PCR
Sau khi nuôi đĩa khuẩn đã biến nạp trên môi trường chọn lọc, thấy xuất hiện khuẩn lạc trắng. Chọn ra một số khuẩn lạc trắng để chạy phản ứng colony - PCR với cặp mồi M13 được thiết kế dựa trên vector pBT để xác định khuẩn lạc có plasmid mang đoạn gen đã đưa vào. Thành phần và chu kỳ nhiệt được thể hiện ở bảng 2.7 và 2.8. Mẫu DNA được thay bằng khuẩn lạc. Sản phẩm PCR chọn dòng được điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X. Sau đó nhuộm gel trong ethidium bromide và chụp ảnh dưới ánh đèn cực tím.
Bảng 2.7. Thành phần của phản ứng colony - PCR STT Thành phần Nồng độ STT Thành phần Nồng độ 1 Nước khử ion 12,5 µl 2 Đệm PCR 10X 2,5 µl 3 MgCl2 (25mM) 2,5 µl 4 dNTPs (25mM) 2,5 µl 5 Mồi xuôi (10pmol/µl) 1 µl 6 Mồi ngược (10pmol/µl) 1 µl 7 Taq DNA polymerase 1 µl 8 Khuẩn lạc
Bảng 2.8. Chu trình nhiệt của phản ứng colony- PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ
( ºC) Thời gian Chu kì
1 Biến tính 94o 4 phút 1 2 Biến tính 94o 30 giây
30 3 Gắn mồi 52o 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72o 90 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72o 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4o ∞
- Tách plasmid tái tổ hợp
Sau khi kiểm tra sản phẩm chọn dòng, tiến hành tách chiết plasmid bằng bộ kit Plassmid Miniprep Kit của hãng Qiagen .
Ly tâm dịch vi khuẩn 7000 vòng/phút trong 5 phút, 4oC. Sau đó loại bỏ dịch nổi, thu cặn. Bổ sung 100μl dung dịch Sol I (lạnh), sau đó lắc nhẹ dịch. Bổ sung 200μl dung dịch Sol II, đảo nhẹ và để trên đá trong 10 phút. Bổ sung 150μl dung dịch Sol III (lạnh), đảo nhẹ và để trên đá trong 10 phút. Sau đó bổ sung 500μl dung dịch chlorofom:isoamyl (24:1), đảo nhẹ và ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút. Thu dịch nổi và bổ sung thể tích tương đương isopropanol (1:1), để ở nhiệt độ -20oC trong 20 phút. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, loại dịch nổi. Rửa tủa 2 lần với ethanol 70% (thể tích mỗi lần là 500μl). Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Bỏ dịch, thu cặn, làm khô. Cho 40μl H2O có bổ sung RNase, ủ ở 37oC trong 1 giờ. Điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm bản gel trong ethidium bromide, chụp ảnh dưới ánh đèn cực tím.