3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số là vật liệu khởi đầu cho mọi nghiên cứu ở mức phân tử. Chất lượng của DNA tổng số có vai trò quan trọng quyết định sự thành công của các thí nghiệm phân tích sinh học phân tử. Do đó, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA của 2 giống đậu tương nghiên cứu ở giai đoạn lá non 7 ngày tuổi theo phương pháp của Gawel và Jarret (1991). Sản phẩm DNA tổng số tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%, sau đó nhuộm ethidium bromide và hiện băng bằng tia cực tím. Kết quả thể hiện trong hình 3.1.
Hình 3.1. Hình ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose
Trong đó M: thang DNA 1kb; giếng 1: ĐT84; giếng 2: ĐT 22
Kết quả hình 3.1 cho thấy mẫu DNA thu được có băng sáng rõ, gọn và ít bị đứt gãy. Độ tinh sạch và hàm lượng của DNA tổng số tách chiết từ 2 giống đậu tương được xác định bằng phương pháp đo trên máy quang phổ. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Giá trị mật độ quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm và 280nm của hai giống đậu tương DT84 và DT22
Tên giống A260 (nm) A280 (nm) Tỷ số A260/A280
Hàm lượng DNA (ng/µl) DT84 0,225 0,121 1,86 2250 DT22 0,282 0,148 1,90 2820
Qua bảng 3.2 cho thấy tỷ số A260/A280 dao động trong khoảng 1,8 - 2,0 chứng tỏ rằng các mẫu DNA tách chiết có độ tinh sạch cao, ít bị lẫn protein có thể sử dụng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Hàm lượng DNA từ 2250 đến 2820 ng/l. Như vậy, sản phẩm tách chiết DNA tổng số đảm bảo độ sạch, chất lượng và hàm lượng cho các thí nghiệm về nhân dòng gen xác định trình tự.
3.2.2. Kết quả nhân gen IFS2 ở cây đậu tương
Sử dụng DNA tổng số làm khuôn để khuếch đại trình tự gen IFS2 bằng phản ứng PCR với cặp mồi IFS2-F và IFS2-R được thiết kế dựa trên trình tự gen IFS2 đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế với mã số JQ934960. Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với các điều kiện khác nhau và nhận thấy rằng phản ứng PCR nhân gen xảy ra tối ưu trong điều kiện nhiệt độ gắn mồi là 58oC. Sau 30 chu kỳ phản ứng, kết quả nhân gen được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% cùng với DNA Marker 1kb( Hình 3.2).
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen IFS2
của 2 mẫu đậu tương DT84 và DT22
Trong đó M: thang DNA 1kb; giếng 1: ĐT84; giếng 2: ĐT 22
Hình 3.2 cho thấy băng DNA khuếch đại sáng rõ, gọn, không bị đứt gãy, có kích thước khoảng 1600 bp phù hợp với tính toán lý thuyết khi thiết kế mồi. Kết quả này chứng tỏ phản ứng PCR thành công, có thể đã nhân được gen IFS2. Ðể có thể khẳng định đoạn DNA nhân bản được chính là gen IFS2
đậu tương, sản phẩm PCR tiếp tục tiến hành tinh sạch, tách dòng và xác định trình tự gen.
1500bp ~1600bp
3.2.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR
Thông thường sau khi chạy PCR, ngoài đoạn gen quan tâm còn có các sản phẩm phụ không mong muốn, các nucleotide dư thừa sau phản ứng, mồi, enzyme... Những chất lẫn tạp này có thể ảnh hưởng đến các kết quả của quá trình tách dòng. Vì vậy, để quá trình biến nạp đạt hiệu quả cao nhất, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm theo quy trình và hóa chất bằng bộ kít PCR AccuPrep PCR Purification Kit (Bioneer).
Các đoạn gen sau khi tinh sạch xong sẽ được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra chất lượng. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR được thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR tinh sạch
Trong đó M: thang DNA 1kb; giếng 1: ĐT84; giếng 2: ĐT 22
Hình ảnh điện di sản phẩm làm sạch gen cho ta thấy một băng DNA duy nhất với kích thước khoảng 1600bp, chứng tỏ đã thu nhận được đoạn gen mong muốn. Các băng vạch rõ nét chứng tỏ các DNA không bị đứt gãy trong quá trình tinh sạch, có thể tiến hành tiếp phản ứng ghép nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT.
3.2.4. Kết quả tách dòng gen
Sản phẩm PCR nhân gen IFS2 sau khi tinh sạch được được gắn vào vector pBT để tạo vector tái tổ hợp bằng enzyme nối T4 ligase. Vector tái tổ
1600bp 1500bp
hợp được biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Sau đó, cấy trải vi khuẩn E. coli DH5α đã biến nạp trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh ampicillin, cơ chất X-gal, chất cảm ứng IPTG ở 37oC trong 16 giờ.
Sau thời gian nuôi, lấy ngẫu nhiên các khuẩn lạc màu trắng để kiểm tra bằng phản ứng colony PCR với cặp mồi M13-F/M13-R nằm trên vector. Sản phẩm colony- PCR bằng điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trong dung dịch TAE 1X, kết quả được thể hiện trên hình 3.4.
Hình 3.4. Hình ảnh sản phẩm colony-PCR
Trong đó M: thang DNA 1kb; giếng 1,2: ĐT84; giếng 3,4,5: ĐT 22
Kết quả hình 3.4 cho thấy, sản phẩm colony-PCR đều xuất hiện một băng DNA đặc hiệu có kích thước khoảng hơn 1600 bp. Kích thước này phù hợp với tính toán lý thuyết của gen IFS2 đã gắn vào vector pBT khi nhân bằng cặp mồi M13. Điều này chứng tỏ, gen IFS2 đã gắn vào vector tách dòng và các dòng khuẩn lạc trắng lựa chọn đều có mang gen IFS2. Các dòng vi khuẩn E. coli có mang tái tổ hợp pBT-IFS2 của giống đậu tương DT22 và DT84 đã được nhân nuôi và tách chiết tinh sạch plasmid. Sản phẩm tách plasmid tái tổ hợp mang gen IFS2 đạt kết quả tốt, đảm bảo chất lượng và số lượng để tiến hành đọc trình tự nucleotide của gen IFS2 (hình 3.5).
Hình 3.5. Hình ảnh điện di plasmid tái tổ hợp BT-IFS2
của giống đậu tương DT22 và DT84
Trong đó M: thang DNA 1kb; X: đối chứng ; giếng 1: DT22; giếng 2: DT84
3.2.5. Kết quả giải trình tự gen
Trình tự nucleotide của gen IFS2 đã tách dòng được đọc trên thiết bị giải trình tự tự động ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) tại viện Công nghệ Sinh học.
So sánh trình tự thu được với cơ sở dữ liệu trình tự gen trong GenBank nhận thấy hai trình tự thu được có độ tương đồng cao với các trình tự gen
IFS2 của cây đậu tương đã công bố. Như vậy, chúng tôi đã khuếch đại, tách dòng và giải trình tự nucleotide thành công gen IFS2 của 2 giống đậu tương DT84 và DT22.
Sử dụng phần mềm DNAstar và Blast phân tích, kết quả cho thấy gen
IFS2 của giống đậu tương DT22 có kích thước 1669bp DT84 có kích thước 1675bp với tỷ lệ các nucleotide thể hiện trong bảng 3.3
Bảng 3.3 Số lượng và tỷ lệ các nucleotide trong gen IFS2
của giống đậu tương DT84 và DT22 Nucleotide Giống A T G C SL % SL % SL % SL % DT22 447 26,8 406 24,34 408 24,46 407 24,4 DT84 446 26,64 408 24,37 412 24,61 408 24,37
Hình 3.6. Trình tự gen IFS2 của giống đậu tương DT22
Hình 3.7. Trình tự gen IFS2 của giống đậu tương DT84
3.3. So sánh trình tự nucelotide của gen IFS2
Khi so sánh trình tự nucleotide gen IFS2 của giống đậu tương DT22 và DT84 với cơ sở dữ liệu gen IFS2 đã công bố trên GenBank chúng tôi nhận thấy, có 01 đoạn intron có 136 nucleotide với trình tự (gtg agtttcctgc ttcattcatt gatcgaaata tgcagtattt tgttaacaag agatcgagaa ttgacattta tatattcatg tggtggcaat taattaacgg tacgcattct taatcgatat tgtgtatgtg cag) từ vị trí 865 đến 1000 của gen
IFS2 giống đậu tương DT22 và vị trí 871 đến 1006 của gen IFS2 giống đậu tương DT84. Như vậy, trình tự mã hóa của gen IFS2 của giống đậu tương DT22 gồm 1533 nucleotide và giống đậu tương DT84 gồm 1539 nucleotide.
Để so sánh trình tự nucleotide của gen IFS2 phân lập từ 2 giống đậu tương nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng các trình tự nucleotide mã hóa của gen IFS2 đã công bố trên GenBank mang các mã số như sau:
Bảng 3.4. Các trình tự đoạn mã hoá của gen IFS2 mang mã số trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI được sử dụng để phân tích [50].
TT Mã số trên
NCBI Quốc gia Năm công
bố Tác giả
1 AY552613 Hàn Quốc 2005 Sohn, S.-I., et al. 2 EU391524 Trung Quốc 2008 Cheng,H., Yu,O. and
Yu,D. 3 EU391523 Trung Quốc 2008 Cheng,H., et al. 4 JN133901 Pháp 2011 Artigot,M.-P., et al. 5 JQ934960 Pháp 2013 Artigot,M.-P., et al.
Sử dụng phần mềm DNAstar phân tích cho thấy, trình tự mã hóa của gen
IFS2 giống đậu tương DT22 tương đồng từ 99,8 đến 100% so với trình tự
IFS2 của đậu tương đã công bố (hình 3.8). Trong đó tương đồng cao nhất (100%) với trình tự IFS2 có mã số JQ934960 (trình tự dùng để thiết kế mồi).
Trình tự mã hóa của gen IFS2 giống đậu tương DT84 tương đồng từ 99,6 đến 99,8% so với trình tự IFS2 của đậu tương đã công bố (hình 3.8). Trong đó
tương đồng cao nhất (99,8%) với trình tự IFS2 có mã số JQ934960 (trình tự dùng để thiết kế mồi) và trình tự IFS2 có mã số JN133901. Khi so sánh với trình tự IFS2 của giống đậu tương DT22 cho thấy trình tự IFS2 của giống DT84 tương đồng 99,8%. Sự sai khác nucleotide trong gen IFS2 của giống DT84 so với giống DT22 và trình tự gen có mã số JQ934960 xảy ra ở các vị trí vị trí 1188 (A → G), vị trí 1192 (T → C) và vị trí 1389 (G → T) (Hình 3.9). Sự sai khác này đã dẫn đến sự thay đổi bộ ba mã hóa tương ứng 396 (AAA→AAG), 398 (TGG→CGG) và 463 (TTG→TTT).
Hình 3.8. Hệ số tương đồng dựa vào trình tự mã hóa (CDS) của DT 84, DT22 và các trình tự tương đồng trên NCBI
Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotide gen IFS2
Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotide gen IFS2
của giống DT84 và DT2 và trình tự tương đồng trên GenBank
Hình 3.10 So sánh trình tự nucleotide gen IFS2
của giống DT84 và DT2 và trình tự tương đồng trên GenBank
Hình 3.9c. So sánh trình tự nucleotide gen IFS2
Phân tích bằng phần mềm DNAstar cho thấy, trình tự protein suy diễn IFS2 của giống đậu tương DT22 có 510 amino acid, trong đó có 71 amino acid có tính ba zơ mạnh (K, R), 61 amino acid có tính acid mạnh (D, E), 194 amino acid có tính kỵ nước (A, I, L, F, W, V), 97 amino acid có tính phân cực (N, C, Q, S, T, Y), còn lại là amino acid không phân cực. Theo tính toán lý thuyết, protein IFS2 của giống đậu tương DT22 có khối lượng 57,7 kDa, điểm đẳng điện Pi = 9,1. Mức độ tương đồng giữa trình tự amino acid suy diễn của protein IFS2 của giống đậu tương DT22 với trình tự amino acid suy diễn từ các trình tự gen IFS2 trên GenBank từ 98,1-100%. Trong đó tương đồng cao nhất (100%) với trình tự amino acid có mã số AFJ80654 suy diễn từ trình tự nucleotide có mã số JQ934960 (trình tự dùng để thiết kế mồi).
Trình tự protein suy diễn IFS2 của giống đậu tương DT22 có 512 amino acid, trong đó có 72 amino acid có tính ba zơ mạnh (K, R), 61 amino acid có tính acid mạnh (D, E), 195 amino acid có tính kỵ nước (A, I, L, F, W, V), 97 amino acid có tính phân cực (N, C, Q, S, T, Y), còn lại là amino acid không phân cực. Theo tính toán lý thuyết, protein IFS2 của giống đậu tương DT22 có khối lượng 57,9 kDa, điểm đẳng điện Pi = 9,2. Mức độ tương đồng giữa trình tự amino acid suy diễn của protein IFS2
của giống đậu tương DT22 với trình tự amino acid suy diễn từ các trình tự gen IFS2 trên GenBank từ 97,7-99,6%. Trong đó tương đồng cao nhất (99,6%) với trình tự amino acid IFS2 của giống DT22 và trình tự amino acid có mã số AFJ80654 suy diễn từ trình tự nucleotide có mã số JQ934960 (trình tự dùng để thiết kế mồi) (hình 3.12).
Hình 3.10. Hệ số tương đồng trình tự amino acid suy diễn của giống đậu tương DT22 và DT84 với các trình tự tương đồng trên GenBank
So sánh trình tự amino acid protein suy diễn IFS2 của giống đậu tương DT22 với giống DT84 và trình tự AFJ80654 nhận thấy: sự sai khác nucleotide gen IFS2 của giống DT84 dẫn đến sự thay đổi bộ ba mã hóa tương ứng 396 (AAA→AAG), 398 (TGG→CGG) và 463 (TTG→TTT). Tuy nhiên bộ ba mã hóa 396 không làm thay đổi amino acid (đây là một đột biến vô nghĩa), bộ ba mã hóa 398 làm thay đổi amino acid Tryptophan (W) thành Arginine (R), bộ ba mã hóa 463 làm thay đổi amino acid Leucine (L) thành Phenylalanine (F) (hình 3.13).
Hình 3.11. So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein IFS2 giống đậu tương DT22, DT84 và trình tự tương đồng trên NCBI
Trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của gen IFS2 của giống đậu tương DT84 có sự sai khác so với giống DT22. Sự sai khác này có thể do trong quá trình tạo giống sử dụng phương pháp đột biến đã làm thay đổi trình tự nucleotide dẫn đến sự thay đổi amino acid. Giống DT84 có hàm lượng isoflavone cao hơn so với giống DT22 (bảng 3.1). Như vậy, rất có thể sự thay đổi amino acid trong phân tử protein đã dẫn đến sự thay đổi hoạt tính của enzyme isoflavone synthase 2 trong giống đậu tương DT84 làm tăng cường khả năng tổng hợp isoflavone. Protein IFS2 của giống DT84 có thể là một protein mới. Lần đầu tiên hai gen mã hóa protein IFS2 của hai giống đậu tương DT84 và DT22 được nhân dòng ở Việt Nam bằng phương pháp PCR với cặp mồi thiết kế đặc hiệu dựa vào trình tự nucleotide của gen mã hóa IFS2
đậu tương có mã số trên GenBank JQ934960.
Từ kết quả phân tích bằng phần mềm DNA star, cây quan hệ di truyền dựa vào trình tự nucleotide và trình tự amino acid của gen IFS2 của đậu tương DT22 và DT84 với các trình tự tương đồng công bố trên GenBank đã được dựng (hình 3.12)
Hình 3.12. Cây quan hệ di truyền gen IFS2 và protein suy diễn của giống đậu tương DT22 và DT84 với các trình tự tương đồng trên GenBank
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận
1. Đã xác định được hàm lượng isoflavone có trong một số giống đậu tương nghiên cứu. Giống DT84 có hàm lượng cao nhất, giống DT22 có hàm lượng thấp nhất trong số các giống nghiên cứu.
2. Đã phân lập, tách dòng và xác định được trình tự nucleotide của gen
IFS2 của 2 giống đậu tương DT84 và DT22. Gen IFS2 của 2 giống đậu tương DT22 có kích thước 1669bp tương đồng 100% và DT84 có kích thước 1675bp tương đồng 99,8% với trình tự gen IFS2 đã công bố trên GenBank.
3. Gen IFS2 của giống DT84 có 3 nucleotide sai khác so với gen IFS2
của giống DT22 và trình tự tương đồng trên GenBank. Trong 3 nucleotide thay đổi có một nucleotide không làm thay đổi amino acid, 2 nucleotide làm thay đổi amino acid ở vị trí 398 Tryptophan (W) thành Arginine (R) và vị trí 463 Leucine (L) thành Phenylalanine (F).
2. Đề nghị
Thiết kế vector biểu hiện mang gen IFS2 đã phân lập nhằm tạo cây đậu tương chuyển gen có hàm lượng isoflavone cao.
TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tiếng Việt:
1. Vũ Đình Chính (2010), Cây đậu tương và kỹ thuật trồng trọt, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội.
2. Ngô Thế Dân (1999), Cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
3. Đường Hồng Dật (2008), Cây đậu tương - Thâm canh tăng năng suất đẩy mạnh phát triển, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
4. Trần Văn Điền (2007), Giáo trình cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 5. Nguyễn Ý Đức (2000), Dinh dưỡng và sức khỏe, Nxb Y học, TP Hồ Chí Minh. 6. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội. 7. Lê Văn Việt Mẫn (chủ biên) (2010), Công nghệ chế biến thực phẩm, Nxb
Đại học quốc gia TP. Hồ Chí Minh
8. Vũ Minh Sơn (2004), Công nghệ sinh học trong chọn giống cây trồng, ĐH Nông nghiệp I, Hà Nội.
9. Nguyễn Việt Thái (2003), Kỹ thuật trồng cây đậu nành, Nxb Đà Nẵng. 10. Phạm Văn Thiều, (2002), Cây đậu tương - Kỹ thuật trồng và chế biến sản
phẩm, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
II. Tiếng Anh:
11. Accorsi Neto A., Haidar M., Simoes R., Simoes M., Soares J., Baracat E. (2009), “Effects of isoflavones on the skin of postmenopausal women: a pilot study”, Clinics (Sao Paulo), 64(6), pp. 505-510.
12. Anderson J.W., Johnstone B.M., Cook Newell M.E. (1995), “Meta- analysis of effects of soy protein intake on serum lipids in humans”, New