Bước Phản ứng Nhiệt độ
( ºC) Thời gian Chu kì
1 Biến tính 94o 4 phút 1 2 Biến tính 94o 30 giây
30 3 Gắn mồi 52o 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72o 90 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72o 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4o ∞
- Tách plasmid tái tổ hợp
Sau khi kiểm tra sản phẩm chọn dòng, tiến hành tách chiết plasmid bằng bộ kit Plassmid Miniprep Kit của hãng Qiagen .
Ly tâm dịch vi khuẩn 7000 vòng/phút trong 5 phút, 4oC. Sau đó loại bỏ dịch nổi, thu cặn. Bổ sung 100μl dung dịch Sol I (lạnh), sau đó lắc nhẹ dịch. Bổ sung 200μl dung dịch Sol II, đảo nhẹ và để trên đá trong 10 phút. Bổ sung 150μl dung dịch Sol III (lạnh), đảo nhẹ và để trên đá trong 10 phút. Sau đó bổ sung 500μl dung dịch chlorofom:isoamyl (24:1), đảo nhẹ và ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút. Thu dịch nổi và bổ sung thể tích tương đương isopropanol (1:1), để ở nhiệt độ -20oC trong 20 phút. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, loại dịch nổi. Rửa tủa 2 lần với ethanol 70% (thể tích mỗi lần là 500μl). Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Bỏ dịch, thu cặn, làm khô. Cho 40μl H2O có bổ sung RNase, ủ ở 37oC trong 1 giờ. Điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm bản gel trong ethidium bromide, chụp ảnh dưới ánh đèn cực tím.
2.3.7. Phương pháp xác định trình tự nucleotide
Các mẫu plasmid mang gen quan tâm có kích thước phù hợp với lý thuyết được sử dụng để giải trình tự bằng máy xác định trình tự tự động ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems - Mỹ).
2.3.8. Phương pháp phân tích trình tự gen
Sử dụng phần mềm BLAST và DNAstar để phân tích và so sánh các trình tự gen.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Hàm lượng isoflavone của các giống đậu tương nghiên cứu
Để có cơ sở so sánh trình tự gen và xác định mối liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình, hàm lượng isoflavone trong hạt của 3 giống đậu tương DT22, DT26, DT84 đã được xác địnhtại Viện Kiểm nghiệm an toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc gia bằng phương pháp HPLC. Kết quả thu được thể hiện ở