Trong ngân hàng gen quốc tế (GenBank), gen IFS2 đã đượ Jung W. và cộng sự công bố năm 2000 với mã số trên trang NCBI là NM_001251586. Năm 2013 nhóm tác giả Artigot,M.-P., Dayde,J. and Berger,M. người Pháp đã công bố trình tự gen IFS2 tổng hợp isoflavone ở đậu tương với mã số trên Genbank JQ934960.
Thông tin về gen IFS2 của đậu tương trên NCBI cho thấy gen nằm trên NST số 13. Số lượng nucleotide của gen là 1824 bp, từ vị trí số 1 đến vị trí 1824, mã hóa cho 521 amino acid, từ vị trí số 1 đến vị trí 521.
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu là 3 giống đậu tương DT22, DT26 và DT84 do Viện Di truyền Nông nghiệp, trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ cung cấp.
Bảng 2.1. Đặc điểm các giống đậu tương nghiên cứu
Stt giống Tên
Nguồn gốc và
phương pháp Đặc điểm
1 DT22
Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ chọn tạo từ dòng đột biến của hạt lai (DT95 x ĐT12) và được Hội đồng Khoa học Công nghệ (Bộ NN&PTNT) công nhận là giống mới Quyết định số 219 QĐ/BNN-KHCN ngày 19/01/2006.
Hoa trắng. Quả chín có màu nâu. Hạt màu vàng sáng, rốn hạt màu nâu đen. Khối lượng 1000 hạt từ 140 - 150 gam. Thời gian sinh trưởng trung bình 85 - 90 ngày.. Giống ĐT22 kháng bệnh phấn trắng.
2 DT84
Viện di truyền nông nghiệp tạo ra từ tổ hợp lai ĐT-80/ĐH4 (DDT96) bằng phương pháp lai hữu tính kết hợp gây đột biến thực nghiệm bằng tác nhân gamma Co60kral trên dòng lai F3-D333
Hoa tím. Quả khi chín màu vàng. Hạt màu vàng tươi, rốn hạt màu nâu nhạt, Khối lượng 1000 hạt 160-180 gam.
Stt giống Tên
Nguồn gốc và
phương pháp Đặc điểm
3 DT26
Giống đậu tương ĐT26 do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ- Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm chọn lọc từ tổ hợp lai giữa ĐT2000 x ĐT12. Được công nhận giống cho sản xuất thử năm 2008 theo Quyết định số 111/QĐ- TT-CCN ngày 03 tháng 06 năm 2008.
Hoa màu trắng, quả chín có màu nâu, có 30-55 quả chắc/cây, hạt vàng, rốn nâu đậm, Khối lượng 100 hạt (18-19 g). Giống ĐT26 nhiễm nhẹ bệnh gỉ sắt, chịu giũi đục thân, chống đổ.
2.2. Hóa chất thiết bị và địa điểm nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất
Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết và thông dụng có nguồn gốc từ Anh, Đức, Mỹ, Thụy Điển, Trung Quốc:
- Hóa chất tách DNA tổng số: gồm có đệm tách (Tris HCl 1M, PH=8,NACl 5M, EDTA 0,5M, CTAB 4% H2O), đệm rửa (Tris HCl 1M , EDTA 0,5M, PH=8, Sobitol 2M, NaH2PO4 0,4%, H2O), dung dịch chloroform/isoamyl ancolhol 24:1, dung dịch Isopropanol,...
- Hóa chất điện di: Đệm TAE 50X: 57,1 ml CH3COOH, 100ml 0,5M EDTA, 242g TRIS- BASE, đệm TAE 1X, agarose, loading dye, ethidium bromide.
- Các hóa chất phục vụ nhân gen: Taq polymerase do hãng Fermentas cung cấp. Cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên trình tự gen IFS2 đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế với mã số NM001249093.
- Hóa chất dùng trong biến nạp: Vector tách dòng pBT của Viện Công nghệ Sinh học, môi trường LB, xgal, IPTG.
- Các bộ kit dùng cho phản ứng PCR QIAquick Gel Extraction Kit, tinh sạch sản phẩm PCR AccuPrep PCR Purification Kit (Bioneer),…và một số hóa chất khác.
2.2.2. Thiết bị
Bảng 2.2. Danh mục các thiết bị đã sử dụng
STT Thiết bị Nguồn gốc, xuất xứ
1 Máy PCR Applied Biosystem - Mỹ
2 Bộ điện di Pharmacia Biotech, Scie-plas Ltd. - Anh 3 Bể ổn nhiệt Memmert - Đức
4 Máy ly tâm Thermo Sci Legend Micro 21R - Mỹ 5 Máy chụp ảnh gel Gel Logic Kodak 1500 - Mỹ
6 Máy lắc Vortex IKA Minishaker MS1 - Đức 8 Cân điện tử Precisa XB1200C - Đức
10 Máy cất nước Cascada Bio-Water - Pall Life - Mỹ/Anh 11 Máy đo quang phổ định lượng NanoDrop Lite Spectrophotometer - Mỹ 13 Tủ lạnh -20oC Sanyo - Nhật Bản
16 Tủ lạnh -4oC Sanyo - Nhật Bản 17 Máy lắc ấm Hàn Quốc
18 Bể ổn nhiệt BW-05G Jeiotech - Hàn Quốc
Cùng với các dụng cụ vô khuẩn cần thiết cho thí nghiệm bao gồm: Đĩa Petri, pipet, ống nghiệm, que cấy, que trang, bình tam giác, đèn cồn,…
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên và Phòng Thí
nghiện trọng điểm Công nghệ gen, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam .
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp phân tích hàm lượng isoflavone trong các mẫu đậu tương nghiên cứu tương nghiên cứu
Hạt đậu tương được sử dụng làm nguyên liệu để xác định hàm lượng isoflavone theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) tại Viện Kiểm nghiệm an toàn Vệ Sinh Thực Phẩm quốc gia bằng phương pháp HPLC. Mẫu được để khô, làm lạnh, sau đó nghiền thành bột mịn. Trộn 2g bột mẫu với 10ml axetonitric (ACN) và 2 ml HCl 0,1N. Hỗn hợp được để trong 2h ở nhiệt độ phòng trước khi đem lọc qua giấy lọc Whatman. Sau khi lọc kiệt, dịch cô được để lạnh khô ở -400C rồi hòa tan lại trong 10ml metanol 80% và lọc qua tia lọc 0.45µm, phân tích trên HPLC.
Phương pháp phân tích định lượng isoflavone được thực hiện theo phương pháp AOAC Official 2006.07 và theo Hao Chen và cs (2001). HPLC là kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha động là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tùy thuộc vào ái lực của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển với tốc độ khác nhau, do đó thứ tự khác nhau. Thành phần pha động đưa chất phân tích ra khỏi cột được thay đổi để rửa giải các chất với thời gian hợp lý [34].
2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Ngâm ủ hạt đậu tương cho nảy mầm rồi gieo trên cát sạch, khi cây được 5 - 7 ngày tuổi sử dụng lá để tách DNA tổng số. Để có thể thực hiện phản ứng PCR nhân đoạn gen cần nghiên cứu, trước hết cần có DNA của hệ gen làm khuôn.
Phương pháp tách DNA tổng số theo theo Gawel và đtg năm 1991 có cải tiến như sau:
- Quy trình tách DNA tổng số: Lấy 200 mg lá non nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn. Bổ sung 0,8 ml đệm rửa, ly tâm 12000 vòng/ phút trong 15 phút, loại bỏ dịch nổi. Bước này làm 2 lần. Thêm 700 µl đệm tách, trộn nhẹ. Ủ ở 65o C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Thêm 600 µl Chloroform : Isoamyl (24:1), trộn đều 20 phút (dùng máy trộn càng tốt). Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút. Hút 500 µl dịch trong ở pha trên sang ống 1,5 µl bỏ tủa. Thêm 500 µl Isopropanol, trộn nhẹ, đặt lên đá (để tủ lạnh qua đêm) chờ có tủa trắng. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. Bổ sung 300 µl cồn 70% búng nhẹ. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ cồn (làm 2 lần). Làm khô DNA bằng cách để trong box bật quạt. Hòa tan DNA trong 50 µl nước khử ion.
2.3.3. Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số
Phương pháp quang phổ hấp thụ.
DNA được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm. Nồng độ DNA được tính theo công thức:
Nồng độ DNA (ng/µl) = A260 x 50 x hệ số pha loãng Độ sạch DNA = A260/A280
Trong đó: A260 là chỉ số đo được ở bước sóng 260 nm A280 là chỉ số đo được ở bước sóng 280 nm.
Nếu tỷ lệ A260/A280 = 1,8 - 2,0 thì DNA đó là tinh sạch.
Mẫu được điện di kiểm tra trên gel agarose. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.
2.3.4. Kỹ thuật PCR
Sau khi tách chiết được DNA tổng số, thực hiện khuếch đại trình tự gen
IFS2 bằng phản ứng PCR với cặp mồi IFS2-F và IFS2-R được thiết kế dựa trên trình tự gen IFS2 đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế với mã số JQ934960 có trình tự như sau:
Bảng 2.3. Cặp mồi nhân gen IFS2
Mồi Trình tự mồi (5’-3’) Nhiệt độ
gắn mồi
IFS2-F cggatccttggttttggctctgtttctgcact 58oC
IFS2-R cgagctcgcatctaaactcctttcttaa 58oC
Thành phần phản ứng PCR nhân gen IFS2 của cây đậu tương được trình bày ở bảng sau:
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nhân gen IFS2
STT Thành phần Thể tích (μl) 1 PCR Master Mix 12,5 µl 2 DNA tổng số (50ng/µl) 1 µl 3 Mồi IFS2-F (10pM/µl) 1 µl 4 Mồi IFS2-R (10pM/µl) 1 µl 5 H2O 9,5 µl Tổng 25 µl
Thực hiện phản ứng PCR nhân gen IFS2 với chu trình nhiệt như sau:
Bảng 2.5. Chu kì nhiệt của phản ứng PCR nhân gen IFS2
Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
Biến tính 94o 3 phút 1 Biến tính 90o 30 giây
30 Gắn mồi 58o 30 giây
Kéo dài chuỗi 72o 90 giây
Hoàn tất kéo dài 72o 10 phút 1 Kết thúc phản ứng 4o ∞
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% với sự có mặt của marker chuẩn, nhuộm bản gel trong ethidium bromide và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.
2.3.5. Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được tinh sạch theo bộ kit AccuPrep PCR Purification Kit của hãng Fermentas:
Quy trình làm sạch sản phẩm PCR như sau: Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%, nhuộm và soi. Cắt lấy băng quan tâm (chứa đoạn gel có kích thước yêu cầu). Bổ sung đệm hòa tan (GB - Gel binding buffer) theo tỷ lệ Vmẫu : VGB = 1 : 5 (quy ước 1μl tương đương 1mg mẫu). Ủ ở 60oC trong 10 phút, khoảng 2-3 phút lắc nhẹ một lần, sau khi gel tan hết thì ủ thêm 5 phút để gel tan hoàn toàn. Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột tinh sạch, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. Bổ sung 500μl đệm GB vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Sau đó đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Bước này nhằm loại bỏ hoàn toàn những thành phần gel agarose còn sót lại. Rửa màng lọc chứa DNA bằng cách thêm 500μl đệm rửa WB (Washing buffer) lên cột. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm lần hai để đảm bảo loại bỏ hết dịch WB.Chuyển cột sang ống eppendorf mới, bổ sung 30μl dung lịch đệm EL (Elution buffer) lên màng lọc, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, sau đó đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ cột, thu dịch chứa mẫu DNA đã tinh sạch chuyển sang ống mới. Bảo quản ở -20oC. Điện di kiểm tra sản phẩm làm sạch gen IFS2.
2.3.6. Kĩ thuật tách dòng gen
- Nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng
Sản phẩm PCR thu nhận được sau khi tinh sạch được gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT. Thành phần của phản ứng gắn gen vào vector như sau:
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nối gen IFS2 vào vector pBT STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O 2 2 Buffer T4 ligase (10X) 1 3 Enzyme nối 1 4 Vector Pbt 1 5 Gen IFS2 5 Tổng 10
Hỗn hợp trên được ủ ở nhiệt độ 22oC trong 1,5 giờ và sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến chủng E. coli DH5α.
Hình 2.1. Cấu trúc vector pBT
- Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủngE. coli DH5α
Tế bào khả biến được lấy từ -80oC, làm tan dần trong đá trong khoảng 30 phút. Lấy 5µl sản phẩm của phản ứng ghép nối gen cho vào ống tế bào khả biến (50µl), đảo nhẹ nhàng để DNA phân bố đều trong dịch tế bào khả biến. Sau đó để sản phẩm plasmid tái tổ hợp trong đá 10 phút. Sốc nhiệt
bằng cách chuyển mẫu vào bể ổn nhiệt với nhiệt độ là 42ºC và ủ trong 90 giây. Lấy mẫu ra rồi đặt ngay vào đá trong 10 phút. Bổ sung 300µl LB lỏng để nuôi lắc 200 vòng/ phút ở 37oC trong 1 giờ. Ly tâm 5000 vòng ở 25ºC trong 5 phút, loại bỏ gần hết dịch nổi, chỉ để lại khoảng 100µl dịch, trộn đều sinh khối lắng để thành dạng huyền phù tế bào. Hút 100µl dịch tế bào và cấy trải trên đĩa môi trường LB đặc bổ sung ampicillin 50mg/l, X-gal, IPTG. Nuôi qua đêm ở 37ºC.
- Kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng PCR
Sau khi nuôi đĩa khuẩn đã biến nạp trên môi trường chọn lọc, thấy xuất hiện khuẩn lạc trắng. Chọn ra một số khuẩn lạc trắng để chạy phản ứng colony - PCR với cặp mồi M13 được thiết kế dựa trên vector pBT để xác định khuẩn lạc có plasmid mang đoạn gen đã đưa vào. Thành phần và chu kỳ nhiệt được thể hiện ở bảng 2.7 và 2.8. Mẫu DNA được thay bằng khuẩn lạc. Sản phẩm PCR chọn dòng được điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X. Sau đó nhuộm gel trong ethidium bromide và chụp ảnh dưới ánh đèn cực tím.
Bảng 2.7. Thành phần của phản ứng colony - PCR STT Thành phần Nồng độ 1 Nước khử ion 12,5 µl 2 Đệm PCR 10X 2,5 µl 3 MgCl2 (25mM) 2,5 µl 4 dNTPs (25mM) 2,5 µl 5 Mồi xuôi (10pmol/µl) 1 µl 6 Mồi ngược (10pmol/µl) 1 µl 7 Taq DNA polymerase 1 µl 8 Khuẩn lạc
Bảng 2.8. Chu trình nhiệt của phản ứng colony- PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ
( ºC) Thời gian Chu kì
1 Biến tính 94o 4 phút 1 2 Biến tính 94o 30 giây
30 3 Gắn mồi 52o 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72o 90 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72o 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4o ∞
- Tách plasmid tái tổ hợp
Sau khi kiểm tra sản phẩm chọn dòng, tiến hành tách chiết plasmid bằng bộ kit Plassmid Miniprep Kit của hãng Qiagen .
Ly tâm dịch vi khuẩn 7000 vòng/phút trong 5 phút, 4oC. Sau đó loại bỏ dịch nổi, thu cặn. Bổ sung 100μl dung dịch Sol I (lạnh), sau đó lắc nhẹ dịch. Bổ sung 200μl dung dịch Sol II, đảo nhẹ và để trên đá trong 10 phút. Bổ sung 150μl dung dịch Sol III (lạnh), đảo nhẹ và để trên đá trong 10 phút. Sau đó bổ sung 500μl dung dịch chlorofom:isoamyl (24:1), đảo nhẹ và ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút. Thu dịch nổi và bổ sung thể tích tương đương isopropanol (1:1), để ở nhiệt độ -20oC trong 20 phút. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, loại dịch nổi. Rửa tủa 2 lần với ethanol 70% (thể tích mỗi lần là 500μl). Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Bỏ dịch, thu cặn, làm khô. Cho 40μl H2O có bổ sung RNase, ủ ở 37oC trong 1 giờ. Điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm bản gel trong ethidium bromide, chụp ảnh dưới ánh đèn cực tím.
2.3.7. Phương pháp xác định trình tự nucleotide
Các mẫu plasmid mang gen quan tâm có kích thước phù hợp với lý thuyết được sử dụng để giải trình tự bằng máy xác định trình tự tự động ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems - Mỹ).
2.3.8. Phương pháp phân tích trình tự gen
Sử dụng phần mềm BLAST và DNAstar để phân tích và so sánh các trình tự gen.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Hàm lượng isoflavone của các giống đậu tương nghiên cứu
Để có cơ sở so sánh trình tự gen và xác định mối liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình, hàm lượng isoflavone trong hạt của 3 giống đậu tương DT22, DT26, DT84 đã được xác địnhtại Viện Kiểm nghiệm an toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc gia bằng phương pháp HPLC. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.1:
Bảng 3.1 . Hàm lượng Isoflavone ở các giống đậu tương
Chỉ tiêu Phương
pháp thử Đơn vị
Hàm lượng isoflavone
DT22 DT26 DT84 Isoflavone HPLC mg/100g 19,7 40,1 57,7
Kết quả bảng 3.1 cho thấy hàm lượng isoflavone trong hạt đậu tương là