Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 55 30 phút 1 Duỗi mạch 94 5 phút 2 Duỗi mạch 94 15 giây 30 Gắn mồi 54 30 giây Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 Hoàn chỉnh 72 5 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 ∞
Chúng tơi tiến hành để xác đinh sự có mặt của virus PED ở lợn có biểu hiện tiêu chảy, chưa được tiêm vacxin phòng PED bằng RT- PCR.
RNA được chiết tách bằng kit QIAamp Viral RNA Minikit (hãng Qiagen), cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để khuếch đại một phần gen S, sản phẩm khuếch đại có kích thước 651bp (Park et al., 2007).
Sau khi thực hiện phản ứng RT-PCR và có kết quả, chúng tơi hồi cứu, tổng hợp lại những triệu chứng lâm sàng chủ yếu đã được ghi chép từ trước.
Xác lợn chết được mổ khám theo tiêu chuẩn trong TCVN 8402: 2010 (Bộ khoa học và Công nghệ, 2010).
3.3.4. Phương pháp nhuộm tiêu bản vi thể
Lợn Mán ni ở lứa tuổi 1- 9 tuần tuổi có kết quả dương tính với virus PED được mổ khám, ghi chép, chụp ảnh để thu thông tin về bệnh tích đại thể và lấy mẫu các mơ gan, lách, thận, phổi, dạ dày, ruột và hạch ruột ngâm vào dung dịch formol trung tính 10% để làm tiêu bản xác định bệnh tích vi thể.
Tiêu bản mơ học bệnh lý được làm theo phương pháp của Prophet, E.B, 1992 bao gồm các bước: (1) Lấy mẫu; (2) khử nước, làm trong; (3) tẩm parafin; (4) đổ block; (5) cắt dán mảnh; (6)nhuộm tiêu bản; (7) gắn lamen, dán nhãn và đọc kết quả bằng kính hiển vi (Prophet and Pathology, 1992).
Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất: lọ formol 10%, dao kéo, pank kẹp, cốc đựng hóa chất, phiến kính, máy đúc block, khn đúc, tủ ấm 37oC, máy cắt mảnh microtom, nước ấm 48 – 52oC, xylen, paraffin, thuốc nhuộm hematoxylin, eosin…
Lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm là dạ dày, ruột, tim, gan, thận, lách…
Cố định bệnh phẩm
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (Chú ý thể tích formol phải gấp 10 lần bệnh phẩm và bệnh phẩm phải ngập trong formol)
Vùi bệnh phẩm
Tiến hành lần lượt các bước sau:
Rửa formol: lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành từng miếng có chiều dài, rộng khoảng 4-5mm. Sau đó rửa dưới vịi nước chảy nhẹ trong 24h.
Khử nước: cho qua hệ thống gồm 3 lọ cồn Cồn I: 3h
Cồn II: 3h Cồn III: 12h
Mục đích: khử nước ra khỏi tổ chức Khử cồn: cho qua hệ thống gồm 3 lọ xylen
Xylen I: 3h Xylen II: 3h Xylen III: 12h
Mục đích: khử hết cồn ra khỏi tổ chức
Yêu cầu: khi nào miếng tổ chức trong như cục thạch là được. Nếu để quá lâu tổ chức sẽ giịn, dễ vỡ và khó cắt.
Khử Xylen: Cho qua hệ thống paraffin đã ổn định, đặc chắc, đồng nhất, khơng lẫn tạp chất, khơng bọt, có từ 3 – 5 % sáp ong đã nấu, gồm 3 lọ.
Paraffin I: 6h trong tủ ấm 56oC Paraffin II: 6h trong tủ ấm 56oC Paraffin III: 12h trong tủ ấm 56oC
Mục đích: khử hết xylen trong tổ chức. Trong tổ chức chỉ cịn paraffin thấm đều trong các kẽ mơ bào.
Đúc block
Mục đích: đưa mẫu bệnh phẩm vào trong khối paraffin tạo thành một thể thống nhất.
Chuẩn bị: Máy đúc block, paraffin.
Phương pháp tiến hành: đặt miếng bệnh phẩm nằm ngang vào chính giữa khn block, đổ nhanh paraffin lỏng vào khuôn block. Đặt khuôn đã đúc sang bàn lạnh của máy đúc khuôn block. Để nguội đến khi block đông cứng đặc chắc là được.
Cắt dán mảnh và cố định tiêu bản
Chuẩn bị: máy cắt, dao cắt, nước ấm 48 -52oC, phiến kính, pank kẹp… Cắt mảnh: bằng máy cắt microtom, với độ dài 3 – 5 µm, sao cho mảnh cắt không rách, nát ở phần tổ chức.
Tãi mảnh: Dùng pank kẹp mảnh cắt đặt vào nước lạnh, dàn nhẹ sao cho mặt dưới của mảnh cắt ướt đều, lấy phiến kính hớt mảnh cất cho sang nước ấm 48 – 52oC rồi vớt mảnh cắt sao cho vị trí mảnh cắt ở 1/3 phiến kính. Sau đó để ở tủ ấm 37oC trong vòng 24h.
Nhuộm tiêu bản
Các bước tiến hành:
Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I: 30 phút
Xylen II: 30 phút Xylen III: 30 phút
Lưu ý: có thể để tiêu bản cần nhuộm vào xylen từ sáng, đến chiều nhuộm để tiêu bản sạch hết parafin
Khử xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 3 lọ: Cồn I : 7 phút
Cồn II : 7 phút Cồn III : 7 phút
Khử cồn: cho dưới vòi nước chảy 10 phút. Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân)
Nhỏ haematoxylin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nước. lau sạch quanh tiêu bản. kiểm tra màu sắc thấy tiêu bản xanh tím là được.
Sau đó cho tiêu bản rửa nước 5 phút loai bỏ hết haematoxylin thừa : Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ eosin ngập tiêu bản 5 – 10 phút, rửa nước chảy cho hết eosin thừa. Tẩy nước:
Cho tiêu bản qua 3 lọ cồn 1000 mỗi lọ 1 phút. Tẩy cồn làm trong tiêu bản:
Cho tiêu bản đi qua 3 lọ xylen, mỗi lọ 3-5 phút
Gắn Baume canada
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản.
Kiểm tra tiêu bản trên kính hiển vi quang học vật kính 10. Nếu thấy màu xanh tím, bào tương bắt màu đỏ tươi, tiêu bản trong sáng. Khơng có nước, khơng có bọt khí là được.
3.3.5. Phương pháp nghiên cứu các chỉ tiêu huyết học
Chúng tôi lấy máu ở vịnh tĩnh mạch cổ của 30 lợn Mán gồm: 15 lợn mắc PED đã được chẩn đốn dương tính (+) với PED bằng kít test nhanh với mẫu phân lấy từ trực tràng của lợn bệnh và 15 lợn khỏe làm đối chứng ở giai đoạn 1-9 tuần tuổi.
- Chúng tôi tiến hành làm chỉ tiêu huyết học để xác định các chỉ số sinh lý máu (dùng máy đo huyết học 18 chỉ số - Celldyn -3700):
Số lượng hồng cầu (triệu/ µl) Hàm lượng huyết sắc tố - Hb (g/l) Tỷ khối hồng cầu (%)
Thể tích trung bình của hồng cầu – MCV (fl)
Nồng độ huyết sắc tố bình quân của hồng cầu – MCH (pg) Lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu – MCHC (g/l) Số lượng bạch cầu (nghìn/ µl)
Công thức bạch cầu (%)
So sánh các chỉ số giữa nhóm đối chứng và PED bằng t test. Kết quả được xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab version 14.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TỶ LỆ MẮC TIÊU CHẢY CỦA LỢN MÁN Ở CÁC
TRANG TRẠI CỦA HÀ GIANG
Để đánh giá mức độ mắc tiêu chảy của lợn mán ở từng độ tuổi, chúng tôi tiến hành theo dõi ở các trang trại chăn nuôi khác nhau trên địa bàn 3 huyện: Bắc Quang, Vị Xun và Hồng Su Phì của tỉnh Hà Giang. Chúng tôi chia ra theo từng tuần tuổi và tiến hành theo dõi lợn từ khi sơ sinh đến 9 tuần tuổi trong khoảng thời gian của năm 2016 đến 2017, sử dụng phương pháp điều tra cắt ngang, dựa trên các triệu chứng lâm sàng đặc trưng kết quả chúng tơi trình bày ở các bảng sau:
Bảng 4.1. Kết quả khảo sát tỷ lệ mắc tiêu chảy trên đàn lợn Mán đã theo dõi nuôi tại Hà Giang
Tuần tuổi Vị Xuyên Bắc Quang Hồng Su Phì
Số đàn Số con Số đàn Số con Số đàn Số con
1 10 95 10 93 10 88 2 10 89 10 86 10 84 3 10 87 10 84 10 80 4 10 87 10 85 10 79 5 10 83 10 84 10 79 6 10 85 10 82 10 76 7 10 82 10 80 10 74 8 10 80 10 77 10 75 9 10 78 10 75 10 72 Tổng 90 766 90 726 90 707
Trong bảng 4.1 chúng tôi đã khảo sát trong 3 huyện về tỷ lệ mắc tiêu chảy ở lợn con từng tuần tuổi từ 1 tuần tuổi đến 9 tuần tuổi cùng một thời gian, mỗi tuần tuổi có 10 đàn và có lợn con theo dõi khác nhau. Huyện Vị Xuyên có lợn con theo dõi nhiều nhất 766 con, huyện Bắc Quang có 726 con theo dõi và ít nhất là huyện Hồng Su phì có 707 con theo dõi.
Số con lợn Mán theo dói nghiên cứu khác nhau bởi vì tùy theo sự hiện có của từng đàn và những trang trại lợn theo dói nghiên cưu trong 3 huyện đã bị tiêu chảy.
Bảng 4.2. Kết quả khảo sát tỷ lệ mắc tiêu chảy trên đàn lợn Mán nuôi tại Vị Xuyên
Tuần
Tỷ lệ mắc theo đàn Tỷ lệ mắc theo số con
Số đàn Số đàn mắc Tỷ lệ (%) Số con Số con mắc Tỷ lệ mắc (%) Số con chết Tỷ lệ chết (%) Tỷ lệ tử vong (%) 1 10 6 60 95 56 58,9 24 25,3 42,86 2 10 5 50 89 45 50,6 19 21,3 42,22 3 10 4 40 87 35 40,2 12 13,8 34,29 4 10 4 40 87 32 36,8 8 9,2 25,00 5 10 3 30 83 15 18,1 2 2,4 13,33 6 10 4 40 85 17 20,0 0 0 0 7 10 2 20 82 10 12,2 0 0 0 8 10 1 10 80 6 7,5 0 0 0 9 10 2 20 78 7 9,0 0 0 0 Tổng 90 31 34,44 766 223 29,11 65 8,49 27,90
Huyện Vị Xuyên nằm ở trung tâm tỉnh Hà Giang, cách thành phố Hà Giang khoảng 20 km về hướng nam, nên có nền kinh tế xã hội phát triển hơn so với các huyện khác và người dân có sử dụng kỹ thuật phịng bệnh trong chăn ni, có sử dụng kỹ thuật vệ sinh thú y khá nhiều hơn so với các huyện khác trong tỉnh Hà Giang. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát tỷ lệ mắc tiêu chảy tổng là 90 đàn lợn, có tỷ lệ mắc theo đàn là 31%; Tổng số con theo dõi là 766 con, tỷ lệ mắc trung bình là 29,11%, tỷ lệ chết trung bình là 8,49% và tỷ lệ tử vong trung bình là 27,90%. Trong bảng 4.2 tỷ lệ mắc theo đàn và tỷ lệ mắc theo số con là khác nhau theo từng tuần tuổi, lợn con mắc tiêu chảy cao nhất là tuần tuổi 1 cao đến 60% (tỷ lệ mắc theo đàn), 58,9% (tỷ lệ mắc theo số con) và giảm đi đến tuần thứ 8 (10% tỷ lệ mắc theo đàn) và 7,5% (tỷ lệ mắc theo số con), tuần thứ 9 đã cao lên (20% tỷ lệ mắc theo đàn và 9% tỷ lệ mắc theo số con).
Bảng 4.3. Kết quả khảo sát tỷ lệ mắc tiêu chảy trên đàn lợn Mán nuôi tại Bắc Quang
Tuần
Tỷ lệ mắc theo đàn Tỷ lệ mắc theo số con
Số đàn Số đàn mắc Tỷ lệ (%) Số con Số con mắc Tỷ lệ mắc (%) Số con chết Tỷ lệ chết (%) Tỷ lệ tử vong (%) 1 10 7 70 93 59 63,4 22 26,9 37,29 2 10 5 50 86 43 50,0 19 22,1 44,19 3 10 5 50 84 35 41,7 14 16,7 40,00 4 10 4 40 85 30 35,7 9 10,6 30,00 5 10 4 40 84 16 19,0 4 4,76 25,00 6 10 3 30 82 17 20,0 4 4,9 23,53 7 10 3 30 80 10 12,2 0 0 0 8 10 1 10 77 6 7,5 0 0 0 9 10 2 20 75 6 8,0 1 1,3 16,67 Tổng 90 34 37,78 726 222 30,58 73 10,06 32,88
Huyện Bắc Quang nằm ở phía dưới của tỉnh Hà Giang, chúng tôi đã tiến hành khảo sát tỷ lệ mắc tiêu chảy tổng 90 số đàn lợn, có tỷ lệ mắc theo đàn là 37,78%; Tổng số con theo dõi là 726 con, tỷ lệ mắc trung bình là 30,58%, tỷ lệ chết trung bình là 10,06% và tỷ lệ tử vong trung bình là 32,88%. Bảng 4.3 cho thấy tỷ lệ mắc theo đàn và tỷ lệ mắc theo số con là khác nhau theo từng tuần tuổi, lợn con mắc tiêu chảy cao nhất là tuần tuổi 1 cao đến 70%(tỷ lệ mắc theo đàn), 63,4% (tỷ lệ mắc theo số con) và giảm đi đến tuần thứ 8 (10% tỷ lệ mắc theo đàn và 7,5% tỷ lệ mắc theo số con), tuần thứ 9 cao lên (20% tỷ lệ mắc theo đàn và 8% tỷ lệ mắc theo số con). Theo quan sát của tơi là tỷ lệ mắc trung bình cao hơn so với huyện Vị Xun bởi vì qui trình chăm sóc ni dưỡng kém hơn huyện Vị Xuyên.
Bảng 4.4. Kết quả khảo sát tỷ lệ mắc tiêu chảy trên đàn lợn Mán ni tại Hồng Su Phì
Tuần
Tỷ lệ mắc theo đàn Tỷ lệ mắc theo số con
Số đàn Số đàn mắc Tỷ lệ (%) Số con Số con mắc Tỷ lệ mắc (%) Số con chết Tỷ lệ chết (%) Tỷ lệ tử vong (%) 1 10 7 70 88 58 65,9 25 28,4 43,10 2 10 6 60 84 44 52,4 18 21,4 40,91 3 10 5 50 80 36 45,0 14 17,50 38,89 4 10 5 50 79 31 39,2 8 10,1 25,80 5 10 4 40 79 18 22,8 4 5,06 22,22 6 10 3 30 76 15 19,7 3 3,90 20,00 7 10 1 10 74 7 9,5 1 1,35 14,29 8 10 2 20 75 8 10,7 1 1,30 12,50 9 10 2 20 72 8 11,1 1 1,40 12,50 Tổng 90 35 38,89 707 225 31,82 75 10,61 33,33
Huyện Hồng Su Phì là một huyện biên giới vùng cao của tỉnh Hà Giang, nhân dân tồn sống ở trên núi và hình thức chăn ni đa số là chăn thả và nhỏ lẻ. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát tỷ lệ mắc tiêu chảy tổng 90 đàn lợn, tổng số con theo dõi là 707 con. Trong bảng 4.4 cho thấy tỷ lệ mắc tiêu chảy trung bình theo đàn và theo số con là cao nhất (38,89% và 31,82% lần lượt) so với huyện Xị Xuyên và Bắc Quang bởi vì cách ni dưỡng kém hơn so với huyện Vị Xuyên và Bắc Quang. Tỷ lệ mắc theo đàn và tỷ lệ mắc theo số con là khác nhau theo từng tuần tuổi, lợn con mắc tiêu chảy cao nhất là tuần tuổi 1 cao đến 70% (tỷ lệ mắc theo đàn), tỷ lệ mắc theo số con 65,9% và giảm đi đến tuần thứ 8 (20% tỷ lệ mắc theo đàn và 10,7% tỷ lệ mắc theo số con). Theo quan sát của tôi là giống như đã giải thích ở bảng 4.3.
4.2. KẾT QUẢ SO SÁNH TỶ LỆ MẮC TIÊU CHẢY CỦA LỢN TẠI 3 HUYỆN CỦA TỈNH HÀ GIANG HUYỆN CỦA TỈNH HÀ GIANG
Để có cơ sở khoa học và có các phác đồ phịng trị bệnh hữu hiệu, chúng tôi tiến hành so sánh tỷ lệ mắc hội chứng tiêu chảy của 3 huyện mà chúng tôi nghiên cứu, nhằm phân tích các nguyên nhân đặc thù của mỗi trại. Kết quả được trình