PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU
3.3.3.Phương pháp tiến hành phản ứng RT – PCR
3.3. PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU
3.3.3.Phương pháp tiến hành phản ứng RT – PCR
Nguyên lý của phản ứng RT – PCR:
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự phát minh ra vào năm 1985. Kỹ thuật này tiếp tục được hoàn thiện, phát triển
thông qua sự phân lập và sản xuất thành công enzyme tổng hợp DNA chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermus aquaticus và sự thiết kế thành cơng các máy chu kì nhiệt cho phép thay đổi nhanh chóng và chính xác nhiệt độ cho từng giai đoạn phản ứng. Trong PCR thơng thường sau 20 – 30 vịng có tới hàng triệu phân tử được coppy từ một phân tử DNA (một đoạn gen).
Phương pháp RT-PCR: bao gồm các bước tách chiết RNA của virus và các bước thực hiện kỹ thuật RT- PCR. RNA của virus được tách chiết bằng kit QIAamp để tiến hành phản ứng RT- PCR. Quy trình tách chiết RNA của virus theo hướng dẫn của nhà sản xuất Kit. RNA được tách chiết từ mẫu bệnh phẩm của lợn nghi mắc PEDV được trộn với hỗn hợp RT-PCR của bộ kit One step RT- PCR kit (invitrogen). Cặp mồi được sử dụng cho phản ứng RT-PCR gồm mồi xuôi 5’-TTCTGAGTCACGAACAGCCA-3’và mồi ngược 5’- CATATGCAGCCTGCTCTGAA- 3’ nhằm khuyếch đại đoạn gen ORF5 dài 651 bp. Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR với 35 chu kỳ. Điện di kiểm tra kết quả RT-PCR ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút. Quan sát kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh.
Các bước tiến hành phản ứng RT – PCR: Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần phản ứng được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng RT – PCR Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (µl) Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (µl) 2X Reaction Mix 12,5 Mẫu RNA 5,0 Primer Forward 0,5 Primer Reverse 0,5
RT/Platium Taq Mix 0,5
Nước cất 6,0
Tổng thể tích 25
Chúng tơi sử dụng cặp mồi một phần gen S với độ dài 651bp, hèm theo Kit tách chiết RNA (QIAamp) do Nhật bản sản xuất.
Bảng 3.3. Nhiệt độ và thời gian trong từng giai đoạn của chu kỳ nhiệt
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 55 30 phút 1 Duỗi mạch 94 5 phút 2 Duỗi mạch 94 15 giây 30 Gắn mồi 54 30 giây Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 Hoàn chỉnh 72 5 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 ∞
Chúng tơi tiến hành để xác đinh sự có mặt của virus PED ở lợn có biểu hiện tiêu chảy, chưa được tiêm vacxin phòng PED bằng RT- PCR.
RNA được chiết tách bằng kit QIAamp Viral RNA Minikit (hãng Qiagen), cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để khuếch đại một phần gen S, sản phẩm khuếch đại có kích thước 651bp (Park et al., 2007).
Sau khi thực hiện phản ứng RT-PCR và có kết quả, chúng tơi hồi cứu, tổng hợp lại những triệu chứng lâm sàng chủ yếu đã được ghi chép từ trước.
Xác lợn chết được mổ khám theo tiêu chuẩn trong TCVN 8402: 2010 (Bộ khoa học và Công nghệ, 2010).