PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU
3.3.4.Phương pháp nhuộm tiêu bản vi thể
3.3. PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU
3.3.4.Phương pháp nhuộm tiêu bản vi thể
Lợn Mán nuôi ở lứa tuổi 1- 9 tuần tuổi có kết quả dương tính với virus PED được mổ khám, ghi chép, chụp ảnh để thu thông tin về bệnh tích đại thể và lấy mẫu các mơ gan, lách, thận, phổi, dạ dày, ruột và hạch ruột ngâm vào dung dịch formol trung tính 10% để làm tiêu bản xác định bệnh tích vi thể.
Tiêu bản mô học bệnh lý được làm theo phương pháp của Prophet, E.B, 1992 bao gồm các bước: (1) Lấy mẫu; (2) khử nước, làm trong; (3) tẩm parafin; (4) đổ block; (5) cắt dán mảnh; (6)nhuộm tiêu bản; (7) gắn lamen, dán nhãn và đọc kết quả bằng kính hiển vi (Prophet and Pathology, 1992).
Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất: lọ formol 10%, dao kéo, pank kẹp, cốc đựng hóa chất, phiến kính, máy đúc block, khn đúc, tủ ấm 37oC, máy cắt mảnh microtom, nước ấm 48 – 52oC, xylen, paraffin, thuốc nhuộm hematoxylin, eosin…
Lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm là dạ dày, ruột, tim, gan, thận, lách…
Cố định bệnh phẩm
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (Chú ý thể tích formol phải gấp 10 lần bệnh phẩm và bệnh phẩm phải ngập trong formol)
Vùi bệnh phẩm
Tiến hành lần lượt các bước sau:
Rửa formol: lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành từng miếng có chiều dài, rộng khoảng 4-5mm. Sau đó rửa dưới vịi nước chảy nhẹ trong 24h.
Khử nước: cho qua hệ thống gồm 3 lọ cồn Cồn I: 3h
Cồn II: 3h Cồn III: 12h
Mục đích: khử nước ra khỏi tổ chức Khử cồn: cho qua hệ thống gồm 3 lọ xylen
Xylen I: 3h Xylen II: 3h Xylen III: 12h
Mục đích: khử hết cồn ra khỏi tổ chức
Yêu cầu: khi nào miếng tổ chức trong như cục thạch là được. Nếu để quá lâu tổ chức sẽ giịn, dễ vỡ và khó cắt.
Khử Xylen: Cho qua hệ thống paraffin đã ổn định, đặc chắc, đồng nhất, khơng lẫn tạp chất, khơng bọt, có từ 3 – 5 % sáp ong đã nấu, gồm 3 lọ.
Paraffin I: 6h trong tủ ấm 56oC Paraffin II: 6h trong tủ ấm 56oC Paraffin III: 12h trong tủ ấm 56oC
Mục đích: khử hết xylen trong tổ chức. Trong tổ chức chỉ còn paraffin thấm đều trong các kẽ mơ bào.
Đúc block
Mục đích: đưa mẫu bệnh phẩm vào trong khối paraffin tạo thành một thể thống nhất.
Chuẩn bị: Máy đúc block, paraffin.
Phương pháp tiến hành: đặt miếng bệnh phẩm nằm ngang vào chính giữa khuôn block, đổ nhanh paraffin lỏng vào khuôn block. Đặt khuôn đã đúc sang bàn lạnh của máy đúc khuôn block. Để nguội đến khi block đông cứng đặc chắc là được.
Cắt dán mảnh và cố định tiêu bản
Chuẩn bị: máy cắt, dao cắt, nước ấm 48 -52oC, phiến kính, pank kẹp… Cắt mảnh: bằng máy cắt microtom, với độ dài 3 – 5 µm, sao cho mảnh cắt không rách, nát ở phần tổ chức.
Tãi mảnh: Dùng pank kẹp mảnh cắt đặt vào nước lạnh, dàn nhẹ sao cho mặt dưới của mảnh cắt ướt đều, lấy phiến kính hớt mảnh cất cho sang nước ấm 48 – 52oC rồi vớt mảnh cắt sao cho vị trí mảnh cắt ở 1/3 phiến kính. Sau đó để ở tủ ấm 37oC trong vòng 24h.
Nhuộm tiêu bản
Các bước tiến hành:
Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I: 30 phút
Xylen II: 30 phút Xylen III: 30 phút
Lưu ý: có thể để tiêu bản cần nhuộm vào xylen từ sáng, đến chiều nhuộm để tiêu bản sạch hết parafin
Khử xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 3 lọ: Cồn I : 7 phút
Cồn II : 7 phút Cồn III : 7 phút
Khử cồn: cho dưới vòi nước chảy 10 phút. Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân)
Nhỏ haematoxylin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nước. lau sạch quanh tiêu bản. kiểm tra màu sắc thấy tiêu bản xanh tím là được.
Sau đó cho tiêu bản rửa nước 5 phút loai bỏ hết haematoxylin thừa : Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ eosin ngập tiêu bản 5 – 10 phút, rửa nước chảy cho hết eosin thừa. Tẩy nước:
Cho tiêu bản qua 3 lọ cồn 1000 mỗi lọ 1 phút. Tẩy cồn làm trong tiêu bản:
Cho tiêu bản đi qua 3 lọ xylen, mỗi lọ 3-5 phút
Gắn Baume canada
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản.
Kiểm tra tiêu bản trên kính hiển vi quang học vật kính 10. Nếu thấy màu xanh tím, bào tương bắt màu đỏ tươi, tiêu bản trong sáng. Khơng có nước, khơng có bọt khí là được.