CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.5. Xác định hàm lƣợng HCA trong mẫu bằng phƣơng pháp
áp (HPLC) [1], [7], [15]
Sắc ký là phƣơng pháp tách, phân ly, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa 2 pha động và pha tĩnh.
Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tƣơng ứng với tính chất của chúng (tính hấp thụ, tính tan, ...) Trong các hệ thống sắc ký, chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký. Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký kết hợp pha tĩnh này đến pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp thụ, phản hấp thụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tƣơng tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà ngƣời ta có thể tách các chất qua q trình sắc ký.
HPLC phân tích: Hệ thống sắc ký lỏng cao áp đƣợc sử dụng để nghiên cứu gồm máy sắc kí lỏng cao áp hãng Shimadzu, model LC 20A trang bị với bơm loại áp suất thấp hãng Shimadzu, và lắp cột sắc kí Shimadzu C18: 250mm x 2,1mm x 5m. Bộ tổng hợp dung môi: quaternary LP Gradient, hãng Shimadzu. Quá trình dị đƣợc thực hiện bằng đetectơ Shimadzu UV: khoảng bƣớc sóng 190 - 740 nm. Pha động gồm 5% (A) ACN và 95% (B) là H3PO4 0,05% với tốc độ dòng 0,25ml/phút. Nhiệt độ lò cột 400
C. Quá trình tách các pic tốt khi chất A trong B thay đổi từ 10- 30% trong thời gian 0- 25 phút, 90% A trong B trong thời gian 30 phút, sau 5 phút cân bằng với 90% A. Chất chuẩn và mẫu đƣợc lọc qua Millipore lọc 0,45m và tiêm vào HPLC.
Xây dựng đƣờng chuẩn: Phƣơng pháp xây dựng đƣờng chuẩn đƣợc thực hiện bằng cách dựa vào kết quả phân tích một chuỗi các mẫu HCA chuẩn. Năm mẫu dung dịch chuẩn chứa 115- 1148ppm HCA tự do đƣợc tiêm vào HPLC, thao tác rửa giải đƣợc thực hiện nhƣ phần thảo luận ở trên, và kết quả thu đƣợc các diện tích pic.
55
Đƣờng cong HCA đƣợc vẽ dựa trên biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ của HCA và diện tích pic (trung bình của 3 lần chạy).
Khoảng nồng độ mẫu chuẩn cần để xây dựng đƣờng chuẩn đƣợc xác định dựa vào nồng độ thực của HCA có trong mẫu. Khoảng nồng độ này tính từ giá trị giới hạn dƣới (LLOQ) đến giá trị giới hạn trên (ULOQ).
Xác định giá trị giới hạn: Giá trị giới hạn (LOQ) đƣợc định nghĩa nhƣ nồng độ thấp nhất của HCA mà có thể xác định với độ tin cậy và chính xác <20%.
Xác định axit hữu cơ có trong mẫu: Mẫu đƣợc chuẩn bị bằng cách pha loãng theo tỉ lệ 1:100 với nƣớc cất 2 lần cất, vỏ quả chƣng ninh với nƣớc cất tỉ lệ 1:50. Thể tích của mỗi mẫu đƣợc tiêm vào HPLC là 20l, HCA thu đƣợc trực tiếp dựa vào diện tích pic, bằng cách áp dụng hệ số pha loãng và sử dụng đƣờng chuẩn. Nồng độ của HCA trong mẫu đƣợc tính bằng g/100g mẫu dựa theo cơng thức sau:
%HCA = [(SI . Am) - Int] . Vdm . Kpl . f Mn . 10000
Trong đó: SI: hệ số góc đƣờng chuẩn; Int: hệ số b của đƣờng chuẩn; Am: diện tích pic sắc kí; Vdm: thể tích mẫu sau khi cơ đặc dùng cho HPLC; Kpl: hệ số pha loãng; Mn: khối lƣợng mẫu (gam); f: Hệ số chuyển đổi giữa HCCa và HCA.
Chất chuẩn: (-)-Calcium threo-hydroxyxitrat tribasic hydrate, cung cấp bởi hãng Sigma-Aldrich, công thức C12H10Ca3O16.xH2O. Thông tin chi tiết của chất chuẩn nhƣ sau:
Số sản phẩm : 55128
Tên sản phẩm : (-)-Calcium threo-hydroxyxitrat tribasic hydrate, BioChemika, Garcinia Cambogia Extract, ~19,5% Ca.
Văn phòng sản xuất : Fluka.
Công thức phân tử : C12H10Ca3O16.xH2O.
Khối lượng phân tử : 530,43 (cơ bản khan). Màu sắc : Hơi nâu.
Dạng tồn tại : Bột.
56
Hàm lượng cacbon : 24,11%. Hàm lượng Hiđro : 2,82%. Phổ 1HNMR : Phù hợp.
Toàn bộ những thông tin trên đƣợc ghi trong Giấy chứng nhận chất lƣợng ngày 4 tháng 2 năm 2005 của hãng Sigma-Aldrich.
Hình 2.10. Lọ chất chuẩn
Chuẩn bị HCA tự do: Calcium threo-hydroxyxitrat tribasic hydrate (50mg) cho vào cốc 50ml chứa 5ml nƣớc, và xử lý với 500mg Dowex 50 [H+]. Hỗn hợp đƣợc khuấy trong thời gian 10 phút, sử dụng khuấy từ. Tách lấy phần dung dịch, và nhựa đƣợc rửa với nƣớc có pH trung tính. Nƣớc rửa và dung dịch đƣợc trộn lẫn tới thể tích 25ml, khuấy trộn và lọc bằng giấy lọc. Chuẩn bị 5 dung dịch chuẩn HCA có nồng độ thay đổi từ 115ppm đến 1148ppm.