CHƯƠNG 2 CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.5. Phương pháp sắc ký lớp mỏng
• Chuẩn bị bản mỏng:
Đế để trải bản mỏng thường là các bản thủy tinh, lá nhôm hoặc màng
poliester. Các loại màng trong suốt với tia tử ngoại có ưu điểm là có thể dùng
đo quang trực tiếp nhiều hợp chất trong bản mỏng.
Chất hấp phụ để trải bản mỏng thường là silica gel, alumin (Al2O3), kizengua, bột xenlulozo,…Chất hấp phụ có thể trải dưới dạng nhão có chất kết dính hoặc dạng bột mịn (khơng có chất kết dính).
Trên thị trường có bán sẵn bản mỏng nhôm/silica gel đã tráng rồi với
kích thước 20 x 20 cm. • Chấm bản mỏng
Trước khi chấm mẫu lên bản, phải vạch “mức xuất phát” cách đáy bản 1 cm và “mức tiền tuyến dung môi” cách đầu bản 0,5 cm. Nếu mẫu là chất lỏng thì chấm trực tiếp. Nếu mẫu là chất rắn, lấy 1 mg mẫu đặt lên mặt kiếng đồng hồ hoặc đựng trong một ống nghiệm nhỏ, hòa tan mẫu với vài giọt dung môi dễ bay hơi. Dùng vi quản nhúng nhẹ phần đầu nhọn vào dung dịch mẫu, lực mao quản sẽ hút dung dịch mẫu vào vi quản, chấm nhẹ phần đầu nhọn có
chứa mẫu lên bản mỏng tại một điểm cách đáy bản mỏng 1 cm. Lấy vi quản
ra khỏi bề mặt thật nhanh để dung dịch mẫu thấm vào bản tạo thành một điểm tròn nhỏ. Thổi nhẹ lên vết chấm để dung mơi bay hơi, có thể chấm thêm lên vết chấm cũ vài lần để có vết đậm rõ, đường kính khơng q 2 mm. Nếu cần
chấm cùng lúc nhiều vết chấm lên cùng một bản thì các vết chấm cách nhau khoảng 1cm và cách hai cạnh bên 1cm.
• Chọn dung mơi triển khai bản mỏng
Dung mơi dùng triển khai tùy thuộc vào mẫu phân tích, với mẫu chưa biết thành phần, chưa có tài liệu tham khảo thì cần thử nghiệm với nhiều loại dung môi khác nhau từ không phân cực đến phân cực.
Để dễ quan sát nên thiết lập một loạt thử nghiệm với những bình triển
khai sắc ký bản mỏng, trong đó mỗi bình chứa một trong các dung mơi với độ phân cực tăng dần (ví dụ: n-hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol). Chuẩn bị các tấm bản mỏng có chấm các mẫu chất như nhau rồi nhúng mỗi tấm vào một bình.
Nếu dung mơi nào khiến cho tất cả các cấu tử nằm tại chỗ mức xuất phát thì dung mơi đó chưa đủ phân cực (dung mơi không phù hợp).
Nếu dung môi nào khiến cho tất cả các cấu tử di chuyển hết lên mức tiền tuyến dung mơi thì dung mơi đó q phân cực (dung mơi khơng phù hợp).
Nếu dung mơi nào có thể làm cho mẫu chất ban đầu tách thành nhiều vết khác nhau một cách gọn, rõ, sắc nét và vị trí của các vết nằm khoảng từ 1/3
đến 2/3 chiều dài bản sắc ký thì dung mơi đó phù hợp.
Nếu qua quá trình triển khai mà nhận thấy hệ thống đơn dung môi không cho những vết gọn, rõ, sắc nét thì cần thử triển khai với hệ thống hỗn hợp dung mơi, ví dụ n-hexane : ethyl acetate hoặc dichlomethan: methanol,…
• Chuẩn bị bình triển khai
Bình hình khối trụ hoặc khối chữ nhật có đường kính lớn hơn bề ngang bản mỏng một ít, tính tốn lượng dung mơi giải ly sao cho khi cho vào bình lớp dung môi dày khoảng 0,5 – 0,7 cm. Cho dung mơi vào bình, để n vài
phút để bão hịa hơi dung mơi trong bình.
Bản mỏng được cầm thẳng đứng và nhúng vào dung mơi trong bình, khi nhúng vào phải cẩn thận để hai cạnh bên của bản khơng chạm vào thành bình, khi đó vị trí của các vết chấm mẫu nằm trên cao cách mặt thoáng của dung
mơi khoảng 0,5 cm.
Đậy nắp bình, nhờ lực mao dẫn, dung môi sẽ được hút lên, theo dõi khi
dung môi lên đến vạch tiền tuyến dung mơi thì lấy bản ra khỏi bình. Sấy nhẹ bản mỏng bằng máy sấy. Soi bản mỏng dưới đèn tử ngoại (UV), dùng viết chì
khoanh nhẹ các vết thấy được, phun bản với các thuốc hiện hình thích hợp. • Cách hiện hình vết sắc ký
Khi làm hiện hình bằng phương pháp hóa học, người ta phun lên bảng một dung dịch thuốc thử có thể tác dụng với các cấu tử của hỗn hợp thành hỗn hợp màu nhìn rõ bằng mắt thường.
Trong phương pháp vật lý, người ta có thể lợi dụng hiện tượng phát quang với các tia tử ngoại, hoặc dùng một chất chỉ thị phát quang tác dụng
được với các cấu tử trong hỗn hợp. Người ta cũng có thể nhận dạng vết sắc ký