6. Tổng quan tài liệu nghiên cứ u
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨ U
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu nghiên cứu là vỏ của cây đỉnh tùng Cephalotaxus mannii
Hook.f. thu ở Lâm Đồng vào tháng 9 năm 2012 và được TS. Nguyễn Tiến Hiệp, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam xác định tên khoa học. Mẫu tiêu bản DTE4718 được lưu giữ tại Phòng tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. Vỏ cây đỉnh tùng được rửa sạch, phơi, sấy khô, sau đó xay thành bột để
chiết lần lượt với các dung môi n-hexane, ethyl acetate (EtOAc), và methanol (MeOH).
2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
Các dụng cụđã được sử dụng trong quá trình nghiên cứu thực nghiệm: - Dụng cụ thủy tinh: bình tam giác, cốc thủy tinh, ống đong, pipet, bình cầu,
ống nghiệm, lọ penixilin, cột sắc ký, phễu thủy tinh, kéo, quả bóp cao su…. - Cân phân tích, máy sấy, máy quay cất Buchi Rotavapor R134 (Thụy Sĩ). - Đèn tử ngoại (UV BIOBLOCK) bước sóng λ = 254nm và λ = 265nm. - Bản mỏng (20 x 20 cm) loại nhôm tráng silica gel 60F254, độ dày 0,2mm.
Dung môi dùng để sắc ký cột và triển khai sắc ký lớp mỏng gồm có: n- hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol loại tinh khiết và đã được cất lại qua cột Vigereux trước khi sử dụng để loại bỏ tạp chất và chất làm mềm dung môi. Thuốc thử phun lên bản mỏng chủ yếu sử dụng Vanilin 1% trong dung dịch CH3OH – H2SO4đặc.
Bảng 2.1. Tên các hóa chất đã sử dụng STT Tên hóa chất Khối lượng mol phân tử (g/mol) Độ tinh khiết Nhiệt độ sôi (0C) Khối lượng riêng (g/ml) Xuất sứ 1 n-hexane (C6H14) 86,20 99% 69 0,6548 Singapore 2 Chloroform (CHCl3) 119,38 99% 61,2 1,48 Singapore 3 Ethyl acetate (CH3COOC2H5) 88,11 99,5% 77 0,897 Singapore 4 Methanol (CH3OH) 32,04 99% 65 0,7918 Singapore 5 Silica gel (0,040 - 0,063mm) 60,09 Đức Các thiết bị dùng để xác định cấu trúc các chất: Máy HP 5989B MS Engine, LC/MSD Agilent.
Máy Bruker Avance 500MHz đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân: 1H-NMR,
13C-NMR, chất nội chuẩn là TMS cho 1H-NMR và tín hiệu dung môi (DMSO, D2O) cho 13C-NMR.
Máy quang phổ IMPACT 410 của hãng Nicolet (Hoa Kỳ) ghi phổ hồng ngoại (FT-IR).
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp chiết mẫu thực vật
• Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng:
Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi. Cao alcol thô ban
đầu hoặc dung dịch ban đầu đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ không phân cực đến phân cực nên rất khó cô lập được riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện khảo sát các bước tiếp theo. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng
được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau.
Nguyên tắc căn bản của sự chiết lỏng – lỏng là sự phân bố của một chất tan vào hai pha lỏng và hai pha lỏng này không hòa tan vào nhau. Hằng số phân bố của một chất tan cho biết khả năng hòa tan của chất này đối với hai pha lỏng tại thời điểm cân bằng, được biểu diễn bằng hằng số phân bố K.
a b C K C =
Ca : Nồng độ của chất tan trong pha (a) tại thời điểm cân bằng Cb : Nồng độ của chất tan trong pha (b) tại thời điểm cân bằng Dung môi để chiết phải đảm bảo các yêu cầu sau:
- Dung môi dùng để chiết phải hòa tan tốt chất cần chiết.
- Không hòa lẫn với dung môi cũ (thường dùng là nước), nghĩa là có tỉ khối khác nhiều với dung môi cũ.
- Dung môi này phải không tương tác hóa học với chất được chiết và có nhiệt
độ sôi tương đối thấp.
• Kỹ thuật chiết rắn – lỏng:
Có thể tiến hành theo các phương pháp chiết nguội và chiết nóng.
Phương pháp chiết nguội: ngâm chất rắn (đã được nghiền nhỏ) trong một dung môi thích hợp trong một thời gian, sau đó gạn hoặc lọc lấy dung dịch rồi
cô đuổi dung môi.
Phương pháp chiết nóng được tiến hành bằng cách đun hồi lưu chất rắn với dung môi trong một thời gian rồi gạn hoặc lọc lấy dung dịch. Để tăng hiệu quả chiết và tiết kiệm dung môi người ta còn dùng bộ dụng cụ chiết liên tục Soxhlet.
Ngoài ra ngày nay người ta còn sử dụng những phương pháp chiết hiện đại với sự kết hợp của các thiết bị khác nhau như: chiết bằng phương pháp CO2 ở
trạng thái siêu tới hạn, phương pháp trích ly có hỗ trợ vi sóng, hỗ trợ sóng siêu âm,….
• Mẫu thực vật cần nghiên cứu thường được chiết theo hai cách:
Cách thứ nhất: Chiết mẫu với dung môi MeOH (thường sử dụng máy siêu âm và áp dụng cho lượng mẫu không quá 500g trong mỗi lần chiết) ở
nhiệt độ thường hoặc có thể tăng nhiệt độ. Thực hiện chiết mẫu với 3 lần. Dịch chiết thu được sẽ được cất loại dung môi dưới áp suất thấp bằng máy quay cất chân không. Thu được cao chiết MeOH tổng. Cao chiết tổng này
được chế thêm nước và chiết phân lớp lần lượt với n–hexan, EtOAc và BuOH bằng phễu chiết. Với mỗi loại dung môi ta cũng thực hiện chiết 3 lần. Các dịch chiết được cất loại dung môi sẽ thu được các cao chiết tương ứng (cao n– hexan, cao EtOAc, cao BuOH) để tiếp tục nghiên cứu.
Cách thứ hai: Mẫu thực vật khô được chiết lần lượt với từng loại dung môi n–hexan, EtOAc và MeOH. Với mỗi loại dung môi được chiết ba lần. Cất loại dung môi dưới áp suất thấp bằng máy quay cất chân không sẽ thu được các cao chiết tương ứng để tiếp tục nghiên cứu.
Trong đề tài này tôi thực hiện việc chiết mẫu theo cách thứ hai.
2.2.2. Phương pháp tách và tinh chế chất
Các cao chiết trong các dung môi khác nhau thu được sẽ được tách và tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột kết hợp với sắc ký lớp mỏng với các hệ
dung môi thích hợp. Sắc ký cột gồm sắc ký cột thường và sắc ký cột nhanh (flash chromatography) sử dụng silica gel. Đối với các chất phân cực có thể
sử dụng Sephadex LH–20 hoặc ngược pha RP–18. Trường hợp cần thiết có thể tiến hành sắc ký cột lặp lại nhiều lần hoặc dùng phương pháp kết tinh phân đoạn, kết tinh lại để tinh chế chất. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất cũng như theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc ký lớp mỏng với hệ
dung môi thích hợp.
2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các chất
Việc xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch được thực hiện thông qua việc kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT–IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D NMR) như 1H–NMR, 13C–NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC. Các loại phổ được đo tại Viện Hoá học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam.
2.2.4. Phương pháp sắc ký cột
Cột sắc ký thường là những ống thủy tinh đường kính d = 0,5 – 5 cm, và có độ dài 20 – 100 cm được nạp đầy chất hấp phụ và pha động. Pha động chuyển động dưới tác dụng của trọng lực, tốc độ chuyển động của pha động
được điều khiển nhờ van lắp ở phía dưới cột.
• Sắc ký cột lỏng-rắn: thường được sử dụng để tách và phân tích các hợp chất hữu cơ. Có hai cách sử dụng sắc ký lỏng-rắn: phương pháp sử dụng chất hấp phụ phân cực kết hợp với dung dịch rửa không phân cực (thuận pha) và phương pháp sử dụng chất hấp phụ không phân cực kết hợp với dung dịch rửa phân cực (nghịch pha).
Trong phương pháp đầu, thời gian lưu và độ chọn lọc của quá trình tách do liên kết đặc thù (chủ yếu là liên kết hydro) giữa các chất cần tách với pha tĩnh và liên kết không đặc thù của chất cần tách với pha động. Khả năng
tương tác của các phần hoạt động của phân tử cần tách với tâm hấp phụ của bề mặt pha tĩnh phụ thuộc nhiều vào cấu trúc không gian của chất cần tách.
Việc tăng các nhóm chức trong phân tử sẽ làm tăng khả năng lưu các chất trên cột do tăng khả năng tạo liên kết hydro giữa các phân tử với chất hấp phụ. Ngược lại, khi tăng độ dài của mạch cacbon của nhóm ankyl thì khả
năng lưu sẽ giảm vì khi đó tương tác đặc thù của hệ chất nghiên cứu-chất hấp phụ hầu như không thay đổi mà liên kết không đặc thù của hệ chất rửa-chất nghiên cứu lại tăng.
Chất hấp phụ dùng cho sắc ký lỏng dạng cột thường là: silica gel, nhôm oxit, chất hấp phụ biến tính, sephadex.
Silica gel: đây là loại pha tĩnh được sử dụng rộng rãi trong sắc ký lỏng- rắn. Silica gel có công thức hóa học là SiO2.xH2O, thuộc loại chất hấp phụ đặc thù. Silica gel làm pha tĩnh trong sắc ký được chế tạo bằng cách thủy giải natri silicat (cho tác dụng với axit sunfuric) để thành axit polysilisic, tiếp theo là sự ngưng tụ và polymer hóa để đạt các chỉ tiêu vật lý cần thiết như có các hạt với kích cỡ hạt, thể tích lỗ rỗng trên bề mặt, diện tích bề mặt,… như yêu cầu.
Silica gel là polymer ba chiều của những đơn vị tứ diện oxyd silicon SiO2, H2O và trên bề mặt hạt gel có những lỗ rỗng. Hạt silica gel sử dụng cho sắc ký cột cổ điển có đường kính hạt trung bình khoảng 40 - 200µm, các lỗ
rỗng có đường kính trung bình khoảng 40 – 300 Å, diện tích bề mặt khoảng 100 – 800 m2/g. Hạt silica gel dùng cho loại sắc ký cột HPLC chỉ để định tính, có diện tích bề mặt 200 – 500 m2/g, có kích thước nhỏ 2 – 8 µm. Hạt silica gel HPLC để cô lập hợp chất có diện tích bề mặt 500 – 800 m2/g, có kích thước lớn hơn 40 – 60 µm.
Bản chất hóa học của bề mặt hạt silica gel là những nhóm silanol-OH,
những chất được sắc ký. Vì thế khi sắc ký cột với cột nhồi bằng silica gel, những hợp chất phân cực (có mang các nhóm -OH, - NH2, -COOH,…) có khả
năng tạo liên kết hydro mạnh, bị silica gel giữ chặt lại trong cột và bị giải ly muộn hơn so với những chất khác có tính kém phân cực như alkan, terpene,..(những hợp chất không chứa những nhóm chức có thể tạo liên kết hydro) ít bị silica gel giữ lại, sẽ ra khỏi cột sớm.
Khi một hợp chất nào đó đang bị silica gel giữ lại trong cột, việc giải ly chất đó ra khỏi cột được hay không còn phụ thuộc vào việc sử dụng dung môi giải ly có độ phân cực mạnh hay yếu. Dung môi nào có thể tạo liên kết hydro mạnh sẽ là dung môi thích hợp để giải ly các chất phân cực mạnh ra khỏi cột silica gel. Methanol thường được chọn để đuổi hết các chất còn sót lại trong cột silica gel. Hơn nữa muốn đuổi hết các chất phân cực như flavonoid glycosis, triterpene glycosis nên dùng 1-2% acid acetic trong methanol. Chú ý rằng khi sử dụng dung môi là methanol hoặc nước, hai loại dung môi này có thể hòa tan một phần nhỏ silica gel khiến cho dung dịch giải ly hứng được có chứa một ít silica gel, gây hiểu lầm rằng đó là hợp chất thu được. Silica gel dễ
dàng hòa tan trong nước có pH nhỏ hơn 7.
Silica gel có tính axit (pH=3,5) nên hấp phụ tốt các hợp chất có tính bazo hơn là các hợp chất có tính axit. Silica gel thường được sử dụng để tách, phân li các hợp chất: hidrocacbon, alcol, phenol, andehit, axit hữu cơ, amin, lipit, ….
Nhôm oxit: bề mặt chất hấp phụ nhôm oxit là hợp chất có tính phân cực mạnh (do các ion nhôm và oxi) tạo nên một trường tĩnh điện mạnh. Chất hấp phụ trên cơ sở nhôm oxit hấp phụ mạnh các hidrocacbon không no, các hidrocacbon mạch vòng (là những phân tử có cấu trúc điện tử hỗn tạp) hơn silica gel.
Chất hấp phụ biến tính: trong sắc ký lỏng hiệu quả cao người ta thường dùng các chất hấp phụ biến tính trên cơ sở silica gel.
Với chất hấp phụ loại này, cân bằng hấp phụ, giải hấp phụ được thiết lập nhanh hơn silica gel thường, độ lặp lại của kết quả phân tích cao hơn. Các chất hấp phụ thường là những hạt dạng hình cầu có kích thước trong khoảng hẹp và diện tích bề mặt 200- 600 m2/g.
Sephadex: Hãng sản xuất Pharmacia, Thụy Điển đã sản xuất loại gel dextran có tên thương mại là Sephadex G. Gel dextran là polyglucose trong
đó các đơn vị glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,6 tạo thành dây dài (gọi là dextran); các dây dài này được nối mạng ngang bởi epiclorohydrin tạo thành polymer rắn không tan trong nước. Gel Sephadex không tan trong nước, bền với tất cả các loại dung môi hữu cơ (tuy có trương nở nhẹ trong dung môi hữu cơ kém phân cực), với nước, nước muối, dung dịch axit hoặc kiềm trong khoảng pH = 2 – 12. Một ưu điểm nữa là cột nhồi sắc ký có thể sử dụng nhiều lần mà không cần phải tái tạo lại gel. Nhược điểm của gel đã trương nở là có thể bị những vi sinh vật tấn công làm hư hại.
Gel Sephadex LH-20 chính là Sephadex G-25, trong đó các nhóm OH
được biến đổi thành hydroxypropyl eter. Gel LH-20 tách các hợp chất theo trọng lượng phân tử với những chất có trọng lượng phân tử khoảng 100 – 4000 dalton. Những hợp chất có trọng lượng phân tử khoảng 4000 dalton thường không bị giữ lại trên cột nên ra khỏi cột ở thể tích chết của cột.
• Lựa chọn dung môi chạy cột sắc ký:
Việc chọn đúng chất làm dung môi chạy sắc ký cột cũng quan trọng như
việc chọn chất hấp phụ. Ở đây có sự cạnh tranh của khả năng tạo liên kết giữa phân tử chất nghiên cứu với pha tĩnh và pha động. Thực nghiệm chứng minh khả năng rửa của dung dịch rửa giải phụ thuộc vào hằng sốđiện môi của dung môi. Khả năng rửa của dung môi cũng tăng lên một lượng không lớn lắm khi thêm dung môi phân cực mạnh hơn vào dung môi ít phân cực.
để dò tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp, với các bước tuần tự như sau: Bước 1: Hoà tan hoàn toàn một lượng nhỏ mẫu chạy cột trong dung môi thích hợp, với nồng độ 10mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A).
Bước 2: Chuẩn bị 4 – 6 tấm bản mỏng rồi chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi tấm với lượng tương đương nhau.
Bước 3: Mỗi bản mỏng được triển khai với một loại dung môi có độ
phân cực khác nhau. Tiếp theo hiện hình các vết trên bản bằng đèn UV hoặc thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào thích hợp. Từ kết quả đó tìm được hệ dung môi (trong đó có một dung môi kém phân cực và một dung môi phân cực, ví dụ CH2Cl2 : CH3OH) phù hợp để chạy cột sắc ký.
Bước 4: Với hỗn hợp mẫu chất là kết quả của một phản ứng tổng hợp (2 – 3 chất) thì hệ dung môi phù hợp là hệ có thể đẩy chất cần quan tâm lên trên bản mỏng với Rf = 0,2 – 0,3.
Với mẫu chất được chiết từ cây cỏ (có chứa nhiều chất từ không phân cực đến phân cực), lựa chọn dung môi chạy cột ban đầu là dung môi đẩy vết kém phân cực nhất lên Rf khoảng 0,5 và dung môi chấm dứt sắc ký là dung môi đẩy vết phân cực nhất lên vị trí ở bản mỏng với Rf khoảng 0,2.
Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp ta thực hiện chạy cột sắc ký với hệ dung môi từ kém phân cực tăng dần đến phân cực.
Chú ý:
Phải sử dụng pha tĩnh của sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột giống nhau. Dung môi ban đầu chạy cột là dung môi phù hợp đã chọn được ở trên nhưng cần điều chỉnh cho độ phân cực kém hơn một ít. Vì chất hấp phụ, ví dụ
như silica gel tráng trên bản mỏng có kích thước nhỏ hơn, độ mịn và độ chặt chẽ lớn hơn so với silica gel khi thực hiện chạy cột sắc ký.