CHƯƠNG 2 CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.4. Phương pháp sắc ký cột
Cột sắc ký thường là những ống thủy tinh đường kính d = 0,5 – 5 cm, và có độ dài 20 – 100 cm được nạp đầy chất hấp phụ và pha động. Pha động
chuyển động dưới tác dụng của trọng lực, tốc độ chuyển động của pha động
được điều khiển nhờ van lắp ở phía dưới cột.
• Sắc ký cột lỏng-rắn: thường được sử dụng để tách và phân tích các hợp chất hữu cơ. Có hai cách sử dụng sắc ký lỏng-rắn: phương pháp sử dụng chất hấp phụ phân cực kết hợp với dung dịch rửa không phân cực (thuận pha) và phương pháp sử dụng chất hấp phụ không phân cực kết hợp với dung dịch rửa phân cực (nghịch pha).
Trong phương pháp đầu, thời gian lưu và độ chọn lọc của quá trình tách do liên kết đặc thù (chủ yếu là liên kết hydro) giữa các chất cần tách với pha tĩnh và liên kết không đặc thù của chất cần tách với pha động. Khả năng
tương tác của các phần hoạt động của phân tử cần tách với tâm hấp phụ của bề mặt pha tĩnh phụ thuộc nhiều vào cấu trúc khơng gian của chất cần tách.
Việc tăng các nhóm chức trong phân tử sẽ làm tăng khả năng lưu các chất trên cột do tăng khả năng tạo liên kết hydro giữa các phân tử với chất hấp phụ. Ngược lại, khi tăng độ dài của mạch cacbon của nhóm ankyl thì khả
năng lưu sẽ giảm vì khi đó tương tác đặc thù của hệ chất nghiên cứu-chất hấp phụ hầu như không thay đổi mà liên kết không đặc thù của hệ chất rửa-chất
nghiên cứu lại tăng.
Chất hấp phụ dùng cho sắc ký lỏng dạng cột thường là: silica gel, nhôm oxit, chất hấp phụ biến tính, sephadex.
Silica gel: đây là loại pha tĩnh được sử dụng rộng rãi trong sắc ký lỏng-
rắn. Silica gel có cơng thức hóa học là SiO2.xH2O, thuộc loại chất hấp phụ
đặc thù. Silica gel làm pha tĩnh trong sắc ký được chế tạo bằng cách thủy giải
natri silicat (cho tác dụng với axit sunfuric) để thành axit polysilisic, tiếp theo là sự ngưng tụ và polymer hóa để đạt các chỉ tiêu vật lý cần thiết như có các hạt với kích cỡ hạt, thể tích lỗ rỗng trên bề mặt, diện tích bề mặt,… như yêu cầu.
Silica gel là polymer ba chiều của những đơn vị tứ diện oxyd silicon
SiO2, H2O và trên bề mặt hạt gel có những lỗ rỗng. Hạt silica gel sử dụng cho sắc ký cột cổ điển có đường kính hạt trung bình khoảng 40 - 200µm, các lỗ
rỗng có đường kính trung bình khoảng 40 – 300 Å, diện tích bề mặt khoảng 100 – 800 m2/g. Hạt silica gel dùng cho loại sắc ký cột HPLC chỉ để định
tính, có diện tích bề mặt 200 – 500 m2/g, có kích thước nhỏ 2 – 8 µm. Hạt silica gel HPLC để cơ lập hợp chất có diện tích bề mặt 500 – 800 m2/g, có kích thước lớn hơn 40 – 60 µm.
Bản chất hóa học của bề mặt hạt silica gel là những nhóm silanol-OH,
những chất được sắc ký. Vì thế khi sắc ký cột với cột nhồi bằng silica gel,
những hợp chất phân cực (có mang các nhóm -OH, - NH2, -COOH,…) có khả năng tạo liên kết hydro mạnh, bị silica gel giữ chặt lại trong cột và bị giải ly muộn hơn so với những chất khác có tính kém phân cực như alkan, terpene,..(những hợp chất khơng chứa những nhóm chức có thể tạo liên kết hydro) ít bị silica gel giữ lại, sẽ ra khỏi cột sớm.
Khi một hợp chất nào đó đang bị silica gel giữ lại trong cột, việc giải ly chất đó ra khỏi cột được hay khơng cịn phụ thuộc vào việc sử dụng dung mơi giải ly có độ phân cực mạnh hay yếu. Dung mơi nào có thể tạo liên kết hydro mạnh sẽ là dung mơi thích hợp để giải ly các chất phân cực mạnh ra khỏi cột silica gel. Methanol thường được chọn để đuổi hết các chất cịn sót lại trong
cột silica gel. Hơn nữa muốn đuổi hết các chất phân cực như flavonoid
glycosis, triterpene glycosis nên dùng 1-2% acid acetic trong methanol. Chú ý rằng khi sử dụng dung môi là methanol hoặc nước, hai loại dung môi này có thể hịa tan một phần nhỏ silica gel khiến cho dung dịch giải ly hứng được có chứa một ít silica gel, gây hiểu lầm rằng đó là hợp chất thu được. Silica gel dễ dàng hòa tan trong nước có pH nhỏ hơn 7.
Silica gel có tính axit (pH=3,5) nên hấp phụ tốt các hợp chất có tính bazo hơn là các hợp chất có tính axit. Silica gel thường được sử dụng để tách, phân li
các hợp chất: hidrocacbon, alcol, phenol, andehit, axit hữu cơ, amin, lipit, ….
Nhôm oxit: bề mặt chất hấp phụ nhơm oxit là hợp chất có tính phân cực
mạnh (do các ion nhôm và oxi) tạo nên một trường tĩnh điện mạnh. Chất hấp phụ trên cơ sở nhôm oxit hấp phụ mạnh các hidrocacbon không no, các hidrocacbon mạch vòng (là những phân tử có cấu trúc điện tử hỗn tạp) hơn
silica gel.
Chất hấp phụ biến tính: trong sắc ký lỏng hiệu quả cao người ta thường
Với chất hấp phụ loại này, cân bằng hấp phụ, giải hấp phụ được thiết lập nhanh hơn silica gel thường, độ lặp lại của kết quả phân tích cao hơn. Các
chất hấp phụ thường là những hạt dạng hình cầu có kích thước trong khoảng hẹp và diện tích bề mặt 200- 600 m2/g.
Sephadex: Hãng sản xuất Pharmacia, Thụy Điển đã sản xuất loại gel
dextran có tên thương mại là Sephadex G. Gel dextran là polyglucose trong
đó các đơn vị glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,6 tạo thành dây dài (gọi
là dextran); các dây dài này được nối mạng ngang bởi epiclorohydrin tạo
thành polymer rắn không tan trong nước. Gel Sephadex không tan trong nước, bền với tất cả các loại dung môi hữu cơ (tuy có trương nở nhẹ trong dung mơi hữu cơ kém phân cực), với nước, nước muối, dung dịch axit hoặc kiềm trong khoảng pH = 2 – 12. Một ưu điểm nữa là cột nhồi sắc ký có thể sử dụng nhiều lần mà không cần phải tái tạo lại gel. Nhược điểm của gel đã trương nở là có thể bị những vi sinh vật tấn công làm hư hại.
Gel Sephadex LH-20 chính là Sephadex G-25, trong đó các nhóm OH được biến đổi thành hydroxypropyl eter. Gel LH-20 tách các hợp chất theo
trọng lượng phân tử với những chất có trọng lượng phân tử khoảng 100 – 4000 dalton. Những hợp chất có trọng lượng phân tử khoảng 4000 dalton thường không bị giữ lại trên cột nên ra khỏi cột ở thể tích chết của cột.
• Lựa chọn dung mơi chạy cột sắc ký:
Việc chọn đúng chất làm dung môi chạy sắc ký cột cũng quan trọng như việc chọn chất hấp phụ. Ở đây có sự cạnh tranh của khả năng tạo liên kết giữa phân tử chất nghiên cứu với pha tĩnh và pha động. Thực nghiệm chứng minh khả năng rửa của dung dịch rửa giải phụ thuộc vào hằng số điện môi của dung môi. Khả năng rửa của dung môi cũng tăng lên một lượng không lớn lắm khi thêm dung môi phân cực mạnh hơn vào dung mơi ít phân cực.
để dị tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp, với các bước tuần tự như sau:
Bước 1: Hoà tan hoàn tồn một lượng nhỏ mẫu chạy cột trong dung mơi thích hợp, với nồng độ 10mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A).
Bước 2: Chuẩn bị 4 – 6 tấm bản mỏng rồi chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi tấm với lượng tương đương nhau.
Bước 3: Mỗi bản mỏng được triển khai với một loại dung mơi có độ
phân cực khác nhau. Tiếp theo hiện hình các vết trên bản bằng đèn UV hoặc
thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung mơi nào thích hợp.
Từ kết quả đó tìm được hệ dung mơi (trong đó có một dung mơi kém phân
cực và một dung mơi phân cực, ví dụ CH2Cl2 : CH3OH) phù hợp để chạy cột sắc ký.
Bước 4: Với hỗn hợp mẫu chất là kết quả của một phản ứng tổng hợp (2 – 3 chất) thì hệ dung mơi phù hợp là hệ có thể đẩy chất cần quan tâm lên trên bản mỏng với Rf = 0,2 – 0,3.
Với mẫu chất được chiết từ cây cỏ (có chứa nhiều chất từ khơng phân
cực đến phân cực), lựa chọn dung môi chạy cột ban đầu là dung môi đẩy vết kém phân cực nhất lên Rf khoảng 0,5 và dung môi chấm dứt sắc ký là dung môi đẩy vết phân cực nhất lên vị trí ở bản mỏng với Rf khoảng 0,2.
Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp ta thực hiện chạy cột sắc ký với hệ dung môi từ kém phân cực tăng dần đến phân cực.
Chú ý:
Phải sử dụng pha tĩnh của sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột giống nhau. Dung môi ban đầu chạy cột là dung môi phù hợp đã chọn được ở trên
nhưng cần điều chỉnh cho độ phân cực kém hơn một ít. Vì chất hấp phụ, ví dụ như silica gel tráng trên bản mỏng có kích thước nhỏ hơn, độ mịn và độ chặt
chẽ lớn hơn so với silica gel khi thực hiện chạy cột sắc ký.
• Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách đối với kích thước cột:
Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì trọng lượng chất hấp thu (như silica gel) phải lớn hơn 20 – 50 lần trọng lượng của mẫu cần sắc ký. Với những hỗn hợp các hợp chất khó tách thì cần sử dụng khối lượng chất hấp thu nhiều hơn (lớn hơn 100 – 200 lần), còn với các hỗn hợp dễ tách thì có thể sử dụng lượng chất hấp thu ít hơn. Vì thế trước khi tiến hành sắc ký, phải dự đoán trước rằng với một lượng mẫu chất muốn tách (x gam)
phải cần bao nhiêu lượng chất hấp thu, sao cho chất hấp thu chiếm một chiều cao phù hợp trong cột mà cột vẫn cịn chỗ để chứa dung mơi. Với lượng chất hấp thu cụ thể phải chọn một cột sắc ký với kích thước phù hợp.
Các khảo sát thực nghiệm cũng cho thấy muốn tách chất tốt, chiều cao của chất hấp thu nạp trong cột cần đạt tỉ lệ là chiều cao chất hấp thu : đường kính trong của cột = 10 : 1. Muốn biết lượng chất hấp thu có phù hợp với kích thước cột thì cho chất hấp thu khơ vào cột để quan sát.
• Nạp silica gel vào cột [2]:
Muốn tách riêng các hợp chất trong hỗn hợp một cách có hiệu quả thì silica gel phải được nạp vào cột một cách đồng nhất để hạn chế những dãy
xéo, bất thường. Trong sắc ký cột hở, dung môi chảy ra khỏi cột nhờ trọng lực nên nếu hạt silica gel có cỡ hạt quá mịn, cột sẽ quá chặt chẽ làm dung môi không thể chảy ra khỏi cột. Để có vận tốc chảy của dung mơi chấp nhận được, kích cỡ hạt silica gel phải lớn hơn 150 µm.
Có hai kiểu nạp silica gel vào cột: nạp sệt và nạp khô
Nạp silica gel dạng sệt:
Cố định cột trên giá. Nếu đầu ra của cột khơng có lớp thuỷ tinh xốp thì ta cho một lớp bông mỏng vào đáy để ngăn không cho silica gel chảy xuống
bình hứng. Cho hệ dung mơi chạy cột ban đầu vào bình đựng (cốc thủy tinh,
cho vào bình đựng đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ và khuấy đều.
Lưu ý:
Không nên thực hiện ngược lại nghĩa là rót dung mơi vào silica gel bởi vì silica gel khi gặp dung mơi sẽ phát nhiệt, có thể làm vón cục, khơng đồng nhất.
Lượng dung môi phải vừa đủ để hỗn hợp khơng được q sệt khiến bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng không được quá lỏng.
Nhất thiết không để đầu cột bị khô, nghĩa là ln ln có dung mơi phủ trên phần đầu cột.
Sau khi nạp cột xong, mặt thoáng silica gel phải phẳng. Nếu mặt thống chưa phẳng ta có thể dùng đũa thuỷ tinh khuấy phần dung mơi sát mặt thống làm xáo trộn phần trên đầu cột rồi để yên cho silica gel lắng xuống từ từ tạo
nên mặt thoáng bằng phẳng.
Với sắc ký cột sephadex ta thao tác tương tự nhưng cần ngâm sephadex với dung môi một thời gian để sephadex trương nở trước khi cho vào cột.
Nạp silica gel dạng khô:
Cột được giữ thẳng đứng trên giá. Cho miếng bông nhỏ vào đáy cột (nếu cột khơng có lớp thuỷ tinh xốp), rót dung mơi chạy cột ban đầu vào khoảng hai phần ba cột.
Cho từ từ silica gel dạng khô vào cột qua phễu lọc, vừa cho vào vừa gõ nhẹ thành cột. Khi lớp silica gel trong cột cao khoảng 2 cm thì mở nhẹ khố và cho dung mơi chảy xuống bình hứng (dung mơi này tiếp tục được rót trở
lại đầu cột).
Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua vài ba lần để cột được ổn định trước khi nạp mẫu vào.
Thông thường người ta nạp silica gel vào cột ở dạng sệt. • Nạp mẫu chất cần tách lên đầu cột sắc ký [2]:
Nạp mẫu chất ở dạng dung dịch:
Thường áp dụng khi mẫu tan hồn tồn trong dung mơi chạy cột ban
đầu. Lượng dung môi dùng hồ tan mẫu càng ít càng tốt, vì lớp dung dịch này
sẽ dàn trải một lớp mỏng trên cột. Có thể áp dụng tính tốn cụ thể như sau: thể tích dung mơi cần lấy để hồ tan mẫu = 0,4.d2 ml, với d là đường kính
trong của cột tính bằng mm. Mẫu được cho trực tiếp vào cột bằng ống hút
mẫu (pipet). Cho mẫu chảy vào từ từ theo thành cột. Với phương pháp nạp mẫu này chúng ta cho dung môi trong cột chảy xuống sát bề mặt silica gel trong cột rồi khoá cột. Sau đó, mở khố để mẫu chảy xuống đến sát bề mặt
silica gel. Cho từng lượng nhỏ dung môi chạy cột vào để mẫu chảy qua bề
mặt silica gel trong cột và rửa sạch thành cột rồi tiến hành chạy cột (để lớp mẫu chất chảy xuống được đồng đều).
Nạp mẫu chất ở dạng bột khô:
Thường áp dụng cho trường hợp mẫu chất không tan hoặc tan kém trong dung môi chạy cột ban đầu. Cách chuẩn bị mẫu: hoà tan hoàn toàn mẫu trong dung mơi thích hợp, cho một lượng silica gel vừa đủ (lượng silica gel cho vào càng ít càng tốt, nhưng phải đủ để có thể cơ quay mẫu được khơ hồn tồn)
vào rồi đem cất quay đuổi dung môi đến khơ hồn tồn. Lấy mẫu đã gắn đều trên silica gel ra, nghiền thành bột mịn. Cột sau khi nạp silica gel được điều
chỉnh lượng dung môi vừa đủ (đủ thấm ướt mẫu khô cho vào). Cho mẫu vào
cột qua phễu một cách từ từ để silica gel đã được gắn đều mẫu thấm đều dung môi tránh tạo bọt khí và tránh để mẫu bị vón cục.
Sau khi nạp mẫu chất cần phân tích vào cột, người ta cho một lớp silica gel mỏng (3-6mm) phủ lên trên để bảo vệ bề mặt cột. Cuối cùng cho dung