Mẫu đệm lót
Đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu: Cân 1g mẫu + 9 ml dd NaCl 0,9% Dung dịch pha loãng mẫu 10-
Lần lượt pha loãng mẫu thành các nồng độ tiếp theo 10-2, ….
Hút 0,1ml dung dịch pha loãng ở mỗi nồng độ cấy lên thạch đĩa TSA
Chọn khuẩn lạc điển hình, nhuộm Gram và thử các phản ứng sinh hóa Ủ ở 37oC/ 24h
3.4.3. Phương pháp xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí
Sử dụng phương pháp cấy láng trực tiếp trên thạch PCA. Mỗi mẫu phải tiến hành nuôi cấy ở ít nhất 3 nồng độ nuôi cấy trên 2 đĩa petri. Ở từng nồng độ pha loãng hút 0,1 ml cho vào đĩa lồng đã được đổ thạch PCA. Dùng ống nghiệm thủy tinh nhỏ, đáy ống phẳng không gồ ghề ria cấy đều trên bề mặt thạch để dung dịch mẫu dàn đều trên bề mặt thạch. Để trong tủ ấm 370C/24 h rồi lấy ra đọc kết quả.
Sau 24 giờ, các đĩa petri được lấy ra để đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường. Chọn tất cả các đĩa có không quá 300 khuẩn lạc để tính kết quả. Sự phân bố của các khuẩn lạc trên đĩa thạch phải hợp lý, với độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít. Nếu kết quả không hợp lý phải tiến hành các bước nuôi cấy lại. Tổng số vi khuẩn hiếu khí được tính theo công thức sau:
Tổng số vi khuẩn hiếu khí (CFU/g) = ∑C/(n1+0.1n2).d Trong đó:
C: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa thạch đã chọn n1, n2: số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tục thứ 1 và thứ 2
3.4.4. Phương pháp xác định vi sinh vật chỉ điểm vệ sinh (Coliform), E. Coli Sử dụng phương pháp cấy láng trực tiếp trên thạch MacConkey (Maria Sử dụng phương pháp cấy láng trực tiếp trên thạch MacConkey (Maria F.C., 2009). Đọc kết quả: trên môi trường thạch Mac Conkey sau khi nuôi cấy 370C/24h, Coliform hình thành khuẩn lạc màu đỏ cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhày, rìa gọn không làm chuyển màu môi trường. Lấy 3-5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang thạch TSI. Để tủ ấm 370C/24 h lấy ra đọc kết quả. Trên thạch TSI,
Coliform làm cho mặt nghiêng và mặt đáy của thạch đều có màu hồng.
Từ những ống dương tính ở trên dùng que cấy vô trùng chạm vào khuẩn lạc kiểm tra rồi ria cấy trên thạch EMB. Để ở nhiệt độ 42,50C/ 24 h sau đó lấy ra đọc kết quả. Khuẩn lạc E.coli phân có mầu ánh kim đặc trưng.
Từ những khuẩn lạc điển hình giám định tiếp tính chất sinh hóa phản ứng IMViC. Nếu là E.coli:
- Phản ứng Indol: E.coli dương tính làm môi trường có màu đỏ, E.coli
không điển hình có phản ứng âm tính màu vàng nhạt.
- Phản ứng đỏ Methyl: Cấy vi khuẩn vào môi trường nước pepton glucogen, ủ 370C từ 24-48h, nhỏ 5 giọt thuốc thử methyred vào, đọc kết quả,
- Phản ứng Voges-Prokauer: E.coli có phản ứng âm tính: không màu hoặc màu vàng.
- Trên môi trường thạch Simon-Citrat: Ria cấy vi khuẩn trên mặt môi trường thạch nghiêng, ủ 370C từ 1-3 ngày E.coli không sinh trưởng phản ứng âm tính.
3.4.5. Phương pháp xác định Salmonella
Phương pháp xác định Salmonella được tiến hành theo sơ đồ sau: