Các vắc xin đã thử nghiệm sản xuất

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) hoàn thiện quy trình sản xuất quy mô công nghiệp vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại công ty TNHH MTV AVAC việt nam (Trang 30)

Các vắc xin thử nghiệm Protein/ ORF sử dụng làm vắc xin

Gây miễn dịch Tính bảo vệ

Kháng thể Miễn dịch tế bào Đồng chủng Dị chủng

Vắc xin DNA ORF1 đến ORF7

+ + + không xác

định được Vắc xin subunit GP5 yếu yếu - không xác

định được Vắc xin peptide tổng hợp GP5 - - không xác định được - Vắc xin dùng Adeno virus làm vector GP3, GP4, GP5 + + không xác định được không xác định được Vắc xin dùng virus giả

dại làm vector

GP5, M + + + không xác

định được Vắc xin dùng virus đậu

làm vector GP3, GP5, M + + + không xác định được Vắc xin dùng virus

viêm đường ruột làm vector GP5, M + không xác định được + không xác định được Vắc xin dùng virus alpha sao chép GP5, M + + + + Vắc xin dùng vi khuẩn lao BCG làm vector GP5, M + - + không xác định được Vắc xin dùng vi khuẩn E.coli làm vector GP5, M + - + không xác định được Vắc xin dùng dẫn xuất

tế bào côn trùng mang kháng nguyên ORF3,5,7 + không xác định được + không xác định được Vắc xin dùng tế bào thực vật mang kháng nguyên GP5 + + không xác định được không xác định được Vắc xin virus PRRS sống đã cắt bỏ gen ở epitop nps2 GP5 + Không xác định được không xác định được không xác định được Ghi chú: + có đáp ứng; - không có đáp ứng

Với vắc xin sống có đánh dấu virus để phân biệt được động vật được tiêm virus vắc xin và động vật bị nhiễm virus hoang dại, De Lina và cộng sự đã tạo một chủng vắc xin tai xanh nhược độc có nsp2 đã cắt bỏ epitop 15- mer và mang một epitop của dòng tế bào B có miễn dịch trội, đã không gây ảnh hưởng đến tính miễn dịch, sinh trưởng hay độc lực của virus đột biến. Những lợn được tiêm vắc xin này đã không sinh ra kháng thể với epitop đã chọn và bảo tồn gen kém, nsp2 có sự biến đổi cao ngay cả ở vị trí đánh dấu. Hình như với virus tai xanh đánh dấu ở nsp2 là không tối ưu, mà có thể đánh dấu ở miền bảo tồn M của virus sẽ tối ưu hơn.

Hình 2.4. Gen từ các chủng virus khác nhau

Với các số liệu đã biết, người ta giả thiết rằng, tất cả các protein cấu trúc của virus PRRS đều là cần thiết cho sự gây bệnh của nó. Cho nên chiến lược của ta cắt bỏ gen để tạo ra virus nhược độc, sẽ bị hạn chế bởi virus nhược độc bị

Gen tráo đổi

Dòng hóa đoạn gen đã tráo đổi vào plasmid DNA chứa bộ gen của virus PRRSV ở dạng DNA (infectious clone = clone truyền nhiễm)

Khuếch đại bằng PCR với mồi đặc hiệu Tái phối hợp bằng PCR mà không dùng mồi

thiếu gen (phải bổ sung gen đó bằng gen của dòng tế bào mà ta dùng nuôi virus). Khi tiêm vắc xin chủng nhược độc vào lợn thì virus vắc xin lại sinh sản trong tế bào không có gen bổ sung, gọi vắc xin đó là vắc xin "1 chu kỳ". Phương pháp này đã làm và tạo ra chủng ORF2 và ORF4, virus này có gây ra kháng thể trung hòa, làm giảm được số lượng virus công độc nhưng không giảm triệu chứng lâm sàng, thậm chí lại tăng cường sự gây bệnh (Martelli et al., 2007).

Đã thử nghiệm chế tạo vắc xin niêm mạc, nhằm gây miễn dịch niêm mạc để bảo vệ, phòng bệnh ngay ở cửa vào của virus PRRS như ở đường hô hấp, đường âm đạo, như kiểu đã dùng ở một số virus khác (Poliovirrus, Influenza virus,... ở người). Đã dùng GP5 và protein N của virus PRRS cho cộng hợp với độc tố Cholera (một yếu tố gây miễn dịch niêm mạc mạnh) để chế tạo vắc xin cho uống, khi uống vắc xin này đã tăng cường được đáp ứng kháng thể trên bề mặt niêm mạc đường ruột, đường sinh dục; nhưng hiệu quả bảo vệ chưa được đánh giá; vắc xin này sau khi tiêm bắp thì không bảo vệ được lợn (không chống được virus máu và bệnh ở đường hô hấp) (Tong et al., 2007).

Đã khảo sát vắc xin cùng với nhiều loại chất bổ trợ (adjuvant) khác nhau cho vắc xin vô hoạt và cả vắc xin sống, chỉ có IL - 12 làm chất bổ trợ có thể tăng cường được đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào của vắc xin nhược độc. Nhưng nếu dùng IL-4 thêm vào làm bổ trợ thì lại có tác dụng ức chế. Tóm lại không có chất bổ trợ nào có tác động tốt hơn so với tiêm vắc xin nhược độc một mình (Charerntantanakul et al., 2006, Martelli et al., 2007).

Đã khảo sát vai trò của đường sử dụng vắc xin PRRS khác nữa như tiêm trong da, so với tiêm bắp và tiêm dưới da cũng không có gì khác biệt lớn (Martelli et al., 2007).

Ngày 7/9/2016, tại Hội nghị thường niên lần thứ 19 của Hiệp Hội Thú y Châu Á (FAVA), giáo sư Fernando đại học Nebraska-Lincoln cho biết, một chủng virus PRRS tổng hợp nhân tạo đã được tạo ra dựa trên một số lượng lớn các trình tự bộ gen virus PRRS đã biết. Virus trung tâm này có thông tin di truyền tương đồng cao nhất với tất cả các chủng thực địa đã biết. Kết quả là virus tổng hợp này đã tạo ra được đáp ứng miễn dịch bảo hộ chéo cao nhất, chưa từng thấy cho đến nay. Virus PRRS-CON có thể là một kháng nguyên tốt để tạo vắc xin tai xanh có độ bảo hộ rộng trên nhiều chủng, nhiều kiểu gen khác nhau.

2.6. CHẤT BỔ TRỢ

Chất bổ trợ là những hợp chất hóa học được thêm vào trong vắc xin nhằm tăng khả năng kích thích miễn dịch và tăng hiệu lực của vắc xin (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010).

Trong quá trình chế tạo, sử dụng thấy rằng nếu vắc xin chỉ chứa kháng nguyên khi dùng tiêm phòng tạo hiệu lực bảo hộ thấp, không kéo dài, phản ứng xảy ra với tỷ lệ cao, nhưng khi cho thêm những chất không phải là kháng nguyên vào vắc xin sẽ làm cho hiệu lực và thời gian bảo hộ của vắc xin tăng lên. Các chất đưa vào vắc xin sẽ được gọi là chất bổ trợ. Vậy chất bổ trợ vắc xin là những chất có hoạt tính kích thích miễn dịch không đặc hiệu dùng bổ sung vào vắc xin nhằm nâng cao hiệu lực và độ dài miễn dịch (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010).

Chất bổ trợ vắc xin có ba tác dụng: Hấp thu và lưu giữ kháng nguyên trong cơ thể lâu hơn, không bài thải nhanh chóng kháng nguyên.

Tạo kích thích đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cơ thể

Giảm kích thích phản ứng của độc tố (nếu có) trong vắc xin đối với cơ thể. Phân loại chất bổ trợ: căn cứ vào bản chất, thành phần cấu tạo của chất bổ trợ, người ta chia chất bổ trợ đang được dùng trong chế bạo vắc xin hiện nay thành các nhóm sau:

Chất bổ trợ vô cơ: bao gồm các các loại muối nhôm, than hoạt tính, alumin hydroxit, … các chất bổ trợ vô cơ thường hấp phụ kháng nguyên lên bề mặt để tăng cường ấp ứng miễn dịch của cơ thể, đồng thời giải phóng kháng nguyên từ từ vào hệ bạch huyết để kéo dài thời gian kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Với mầm bệnh có sản sinh độc tố, sau khi đã được vô hoạt (giải độc tố) cũng được chất bổ trợ hấp thu và giải phóng từ từ để hạn chế tác động gây phản ứng cục bộ và toàn thân. Trong thú y người ta hay dùng Aluminium Hydroxide hay AlK(SO4)2.12H2O (gọi là keo phèn) trong các vắc xin vi khuẩn vô hoạt.

Chất bổ trợ hữu cơ: bao gồm các loại dầu thực vật, dầu hướng dương, dầu lạc, dầu oliu, ……Các chất bổ trợ hữu cơ khi hỗn hợp với kháng nguyên sẽ tạo thành dạng nhũ tương nước trong dầu. Ở dạng nhũ tương kháng nguyên sẽ nằm trong dung dịch dầu. Để khắc phục những nhược điểm của vắc xin nhũ nước

trong dầu như dễ phân lớp, rít kim khi tiêm, về sau người ta đã nghiên cứu chế tạo ra loại vắc xin dạng nhũ tương kép như dầu khoáng kép MONTANIDETM ISA 201 VG, MONTANIDETM ISA 206 VG, MONTANIDETM ISA 207 VG.

Tác dụng của chất bổ trợ dầu trong vắc xin cũng tương tự như tác dụng của chất bổ trợ vô cơ. Nhờ các phức hợp nhũ kháng nguyên - dầu - nước mà kháng nguyên tự do được giải phóng từ từ vào cơ thể để kích thích sản sinh kháng thể và tế bào miễn dịch đặc hiệu kéo dài. Đồng thời các hạt nhũ cũng di chuyển từ chỗ tiêm vào các hạch lympho hoặc đến các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch để kích thích miễn dịch không đặc hiệu. Kết quả là liều vắc xin giảm, hiệu lực miễn dịch tang cao, thời gian miễn dịch kéo dài.

Chất bổ trợ là vi sinh vật: thường dùng là xác của một số loài vi khuẩn như Mycobacterium tuberculosis hay Salmonella typhimurium. Cũng có thể dùng nội độc tố của các vi khuẩn lipopolysaccarid.

PHầN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 10/2018 đến tháng 05/2019.

3.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu được thực hiện tại công ty TNHH MTV Avac Việt Nam.

3.3. NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƢỢNG SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

3.3.1. Đối tƣợng, vật liệu

- Giống vắc xin phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn được cung cấp từ đề tài KC.04.15/11-15 chủng KTY-PRRS-01, hiệu giá virus giống gốc đạt 3.03x106 TCID50 /ml (Phạm Văn Sơn và cs., 2017).

3.3.2. Hóa chất bất hoạt

- BEI (Binary Ethylenimine) - Formaldehyde 35%

3.3.3. Chất bổ trợ

- Nhũ dầu khoáng kép MONTANIDETM ISA 201 VG

3.3.4. Các loại dung dịch, môi trƣờng

3.3.4.1. Môi trường cho quá trình nuôi tế bào Marc – 145 và nhân virus PRRS

- PBS 1X (Phosphate Buffered Saline) - Penicillin/Streptomycin

- DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)

- Trypsin-EDTA

- FBS (Fetal Bovin Serum), NBCS (Newborn Calf Serum) Đệm Hepes

3.3.4.2. Môi trưri s PRRS Goat PAb to

- TSB (Trypticase Soybean) - TSA (trypticase soy agar) - SD ( sabouraud dextrose agar) - Canh thang PPLO

- XLD (Xylose Lysine

Deoxycholate)

- FTM (fruit thioglycolate agar) - Thạch máu

3.3.4.3. Môi trường, hóa chất cho thử nghiệm IPMA - Thuốc khử trùng: Virkon, Chloroform - PBS 1X (Phosphate Buffered Saline) - Penicillin/Streptomycin

- DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)

- FBS (Fetal Bovin serum) - Acetyl Ethyl Carbazole (AEC) - H2O2 Hydrogen peroxide 30% - Tween 80 - Dimethylformamide (DMEF) - Formaldehyde 37 % - Virus PRRS - Nonidet P40 Substitute - Sodium acetate

- Glacial acetic acid - Trypsin

- Trypan blue - Skim milk powder

- Thuốc khử trùng: Virkon 1% hoặc Chloramine 2-3%, Chloroform. - Tế bào Marc - 145

- Huyết thanh đối chứng dương - Huyết thanh đối chứng âm

- Conjugate: Goat PAb to Pig IgG (HRP) ab102135 1mg/1ml (Ab cam)

3.3.4.4. Môi trường thực hiện phản ứng Elisa phát hiện kháng thể PRRS

- Nước cất hoặc nước đã khử khoáng - Môi trường phát triển tế bào DMEM có chứa FBS (huyết thanh bào thai bê)

- Formalin 37%

- Sữa gầy (skim milk) - Dung dịch NP40

- Dung dịch peroxidase (H2O2) 30% - Dung dịch AEC

3.3.4.5. Môi trường sử dụng kiểm tra vô hoạt virus trong sản xuất vắc xin

- Môi trường DMEM đã bổ sung 2% FBS, 100 UI penicillin và 100µg streptomycin/1ml

- Dung dịch PBS 1X (Photphat Buffer Saline), Trypsin-EDTA - Huyết thanh bào thai bê FBS (Fetal bovine serum)

3.3.5. Trang thiết bị, dụng cụ

3.3.5.1 Trang thiết bị

- Tủ an toàn sinh học cấp 2 - Máy ly tâm lạnh

- Tủ lạnh âm sâu 800C, tủ lạnh âm 400C - Hệ thống chai lăn tế bào

- Phòng ấm có hệ thống cung cấp CO2 - Tủ ấm 37, tủ ấm CO2

- Water bath

- Máy bơm hút chân không - Tank bất hoạt vắc xin - Tank nhũ hóa vắc xin.

- Hệ thống chia liều – Viền nắp tự động.

- Máy cất tế bào

- Cân phân tích

- Nồi hấp tiệt trùng (Autoclave)

- Máy đọc ELISA Elx800 đọc được bước sóng từ 605nm-630 nm

- Máy Voltex - Máy phá vỡ tế bào - Bể ổn nhiệt (water bath) - Kính hiển vi soi ngược - Kính hiển vi thường

- Pipette điện tự động

- Máy lọc tiếp tuyến TFF

- Pipettes: 10-100µl, 100-1000 µl, Multi Pipettes 10-100 µl. 50-200 µl

3.3.5.2. Dụng cụ

- Chai roller, T75, T225 nuôi tế bào - Chai thủy tinh trung tính dung tích

100 ml, 200 ml, 500 ml và 1000 ml - Ống đong thủy tinh, dung tích 50

ml, 100 ml, 200 ml, 500 ml và 1000 ml

- Micropipet đơn kênh, dung tích từ 0,5 l đến 10 l, từ 20l đến 200l, từ 100 l đến 1000 l - Pipet 8 kênh (30-300l) - Ống nghiệm vô trùng: ống eppendorf 1,7ml- 2ml - Lam kính đếm tế bào - Tip 200 µl, 100 µl có lọc, Tip 200 µl, 100 µl - Máng - Tube 50ml, 15ml - Lọc 0.45 µm, lọc 0.22 µm - Đĩa 96 giếng nuôi cấy tế bào - Chai T75, T25, T175 và T225 - Ống 1.5ml (eppendorf)

- Pipette 15ml, 20ml

- Găng tay, khẩu trang, giấy lau - Dụng cụ chứa rác thải

3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.4.1. Nghiên cứu sản xuất vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn quy mô công nghiệp loạn sinh sản và hô hấp ở lợn quy mô công nghiệp

3.4.1.1. Nghiên cứu quy trình sản xuất kháng nguyên virus PRRS trên hệ thống chai roller

3.4.1.2. Nghiên cứu quy trình bất hoạt kháng nguyên, sản xuất bán thành phẩm vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 3.4.1.3. Kiểm tra trong quá trình sản xuất (IPC)

3.4.2. Kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn ở quy mô công nghiệp sản và hô hấp ở lợn ở quy mô công nghiệp

3.4.2.1. Kiểm tra cảm quan 3.4.2.2. Kiểm tra thuần khiết 3.4.2.3. Kiểm tra an toàn 3.4.2.4. Kiểm tra hiệu lực

3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1. Quy trình tóm tắt sản xuất vắc xin PRRS trên quy mô công nghiệp

Quy trình sản xuất vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loại sinh sản và hô hấp ở lợn là quy trình khép kín, toàn bộ quá trình sản xuất, kiểm tra trong quá trình và kiểm nghiệm đều được kiểm soát nghiêm ngặt, tuân thủ chặt chẽ các yêu cầu của tiêu chuẩn GMP-WHO về sản xuất chế phẩm sinh học vô trùng trong đó đặc biệt là chỉ tiêu vô trùng và an toàn. Vì vậy, các nguyên liệu đưa vào để phục vụ sản xuất vắc xin phải được lựa chọn kỹ lưỡng, đúng tiêu chuẩn, đồng thời tỷ lệ của các chất đưa vào vắc xin cũng phải thích hợp. Trên cơ sở đó, vắc xin sản xuất ra mới đảm bảo chất lượng.

Nhân giống sản xuất

Hình 3.1. Sơ đồ sản xuất vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp theo quy mô công nghiệp

3.5.2. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào

3.5.2.1. Hồi phục tế bào từ nguồn giống bảo quản ở lạnh sâu

- Chuẩn bị 5ml môi trường DMEM 5% FBS, làm ấm trong tủ ấm 37o

C 30 phút trước khi mở giống, cốc nước ấm và dụng cụ kèm theo.

- + Bước 1 Đông tan: lấy 1 ống tế bào ra khỏi nitơ lỏng, đặt vào cốc nước sạch 370C, chuyển vào phòng làm tế bào, chờ tan đông.

Ra chai, hoàn thiện sản phẩm Cô đặc kháng nguyên (hiệu giá tối

thiểu 108 TCID50/ml)

Bất hoạt virus (trên tank bất hoạt)

Nhũ hóa, bổ sung chất bổ trợ (trên tank nhũ hóa – phối trộn

Gây nhiễm virus (20 ml/chai roller 2X) Giống gốc vắc xin

chủng KTY-PRRS-

01 Nhân giống tế bào phục

vụ sản xuất. (300-500 chai roller 2X)

Thu hoạch huyễn dịch virus (100 lít kháng nguyên/mẻ)

Kiểm nghiệm thành phẩm (cảm quan, an toàn, vô trùng, hiệu lực).

- + Bước 2 Cân bằng môi trường: dùng pipette hút 5ml môi trường DMEM 5% FBS vào ống li tâm. Sau đó hút chuyển huyễn dịch tế bào từ ống tế bào đã giải đông sang ống li tâm đã có 5ml DMEM 5% FBS rồi trộn đều.

- + Bước 3 Ly tâm loại bỏ dung dịch bảo quản: ly tâm 700 vòng/phút trong 10

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) hoàn thiện quy trình sản xuất quy mô công nghiệp vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại công ty TNHH MTV AVAC việt nam (Trang 30)