Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.3.2.Kiểm tra vô trùng
4.3. Kiểm nghiệm thành phẩm vắc xin
4.3.2.Kiểm tra vô trùng
Mỗi lô sản xuất vắc xin lấy 03 mẫu để kiểm tra sự vô trùng của vắc xin trên các môi trường: TSB, TSA, SD, XLD, FTM,TM (theo TCVN 8684:2011, mục kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn và kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc).
Kết quả kiểm tra vô trùng vắc xin lô PR1- 0118, PR1- 0119 PR1- 0219 và được thể hiện các bảng sau:
Bảng 4.19. Kết quả kiểm tra vô trùng vắc xin
STT Số lô Mẫu Môi trƣờng
Kết luận TSB TSA FTM TM XLD SD 1 PR1- 0118 1 - - - Vô trùng 2 - - - Vô trùng 3 - - - Vô trùng 2 PR1- 0119 1 - - - Vô trùng 2 - - - Vô trùng 3 - - - Vô trùng 3 PR1- 0219 1 - - - Vô trùng 2 - - - Vô trùng 3 - - - Vô trùng
Chú thích: (-): âm tính, trong suốt, không đổi màu, không có bất kỳ khuẩn lạc, nấm mốc phát triển (+): Dương tính: Môi trường đục, vẩn hoặc có khuẩn lạc phát triển.
Quá trình kiểm tra vô trùng được áp dụng theo TCVN 8684:2011. Đến ngày thứ 14, tất cả các môi trường thử nghiệm đều trong suốt, mầu sắc môi trường không đổi, chứng tỏ những lô vắc xin mà chúng tôi sản xuất ra đạt tiêu chuẩn về vô trùng đối với vắc xin vô hoạt.
Hình 4.8. Một số hình ảnh kiểm tra vô trùng sản phẩm4.3.3. Kiểm tra an toàn 4.3.3. Kiểm tra an toàn
An toàn là chỉ tiêu quan trọng của vắc xin, mỗi vắc xin sử dụng phòng bệnh cho động vật đều phải đạt chỉ tiêu này, mỗi một lô vắc xin sản xuất ra chúng tôi kiểm tra an toàn theo TCVN 8685-13:2014 sử dụng phương pháp trọng tài bố trí thí nghiệm như sau:
Bố trí thí nghiệm gồm 15 lợn khoẻ mạnh (mỗi lô 5 con) được tiêm liều gấp 2 lần so với liều quy định (4ml/con). Theo dõi lợn 21 ngày sau tiêm với các biểu hiện cục bộ và biểu hiện toàn thân về triệu chứng lâm sàng, tình trạng ăn uống, phản xạ tự nhiên, thân nhiệt, trong thời gian 21 ngày. Kết quả thể hiện ở bảng 4.20 như sau:
Bảng 4.20. Kết quả kiểm tra an toàn vắc xin PRRS ở lợn thí nghiệm
Lô vắc xin Liều tiêm vắc xin (ml) Phản ứng cục bộ (n=5/nhóm) Phản ứng sốt (n=5/nhóm) Đánh giá Trƣớc khi tiêm vắc xin Sau khi tiêm vắc xin Trƣớc khi tiêm vắc xin Sau khi tiêm vắc xin PR1-0118 4 0/5 0/5 0/5 0/5 Đạt PR1-0119 4 0/5 0/5 0/5 0/5 Đạt PR1-0219 4 0/5 0/5 0/5 0/5 Đạt
Từ kết quả ở bảng 4.20 thấy rằng ở liều tiêm gấp 2 lần vắc xin vô hoạt PRRS, lợn thí nghiệm đều sống khoẻ mạnh, ăn uống bình thường, không có phản ứng cục bộ, có phản ứng sốt nhẹ (tăng 0,5 °C sau khi tiêm từ 3 đến 5 ngày). Như vậy vắc xin vô hoạt PRRS đạt chỉ tiêu an toàn
Để minh họa rõ hơn chúng thể thể hiện sự biến đổi thân nhiệt lợn thí nghiệm theo đồ thị dưới đây:
Hình 4.9. Thân nhiệt lợn kiểm tra an toàn
Hình ảnh lợn trước khi kiểm tra an toàn
Hình ảnh lợn sau khi tiêm vắc xin
Hình 4.10. Kiểm tra an toàn vắc xin
37.8 38 38.2 38.4 38.6 38.8 39 39.2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42
4.3.4. Kiểm tra hiệu lực
Để có thể đánh giá được khả năng phòng bệnh, bảo hộ của vắc xin cho vật nuôi, thì yếu tố hiệu lực của vắc xin là rất quan trọng, vì vậy việc kiểm tra hiệu lực cho mỗi loại vắc xin là công việc bắt buộc và cần thiết.
Vắc xin vô hoạt PRRS được kiểm nghiệm chỉ tiêu hiệu lực theo TCVN 8685-13:2014 bằng phương pháp trọng tài. Mỗi lô vắc xin bố trí 2 lô lợn, lô thí nghiệm (5 lợn) và lô đối chứng (3 lợn), lô thí nghiệm tiến hành gây miễn dịch bằng cách tiêm vắc xin 2 lần, mỗi lần 1 liều vắc xin, lần 1 khi lợn 21 ngày, lần 2 khi lợn 42 ngày tuổi, khi lợn 70 ngày tuổi 5 con lợn được thí nghiệm và 3 con lợn đối chứng được tiến hành lấy máu chắt huyết thanh và công cường độc bằng chủng KTY-PRRS-01: 100 TCID50/con (Phạm Văn Sơn, 2018), lấy máu tại thời điểm lợn 70 ngày và 91 ngày tuổi, theo dõi lợn sau công cường độc 21 ngày.
Hình 4.11. Ảnh lấy máu kiểm tra kháng thể kháng VIRUS PRRS
Kết quả đánh giá hiệu giá kháng thể PRRS bằng phương pháp Elisa tại lô PR1-0118, 0119, 0219 được thể hiện tại bảng sau:
Bảng 4.21. Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phương pháp ELISA Lô vắc xin Nhóm Lô vắc xin Nhóm Giá trị S/P Tỷ lệ dƣơng tính 0dpi 21dpi PR1-0119 Thí nghiệm 1 0.06 1.72 100% 2 0.03 0.87 3 0.05 1.85 4 0.07 1.37 5 0.07 0,96 Đ/C 1 0.03 0.34 2 0.03 0.22 3 0.05 0.18 PR1-0119 Thí nghiệm 1 0,06 1.28 100% 2 0.07 1.41 3 0.10 0.97 4 0.17 1.32 5 0.12 0.95 Đ/C 1 0.06 0.12 2 0.02 0.2 3 0.05 0.16 PR1-0219 Thí nghiệm 1 0.03 1.45 100% 2 0.07 0.87 3 0.04 1.27 4 0.02 1.55 5 0.08 1.01 Đ/C 1 0.03 0.25 2 0.07 0.32 3 0.004 0.18
Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng virus PRRS bằng phương pháp ELISA cho thấy các lô đối chứng không phát hiện kháng thể dương tính sau 21 ngày tiêm vắc xin ở cả 3 lô thí nghiệm. Trong khi đó lô thí nghiệm tại 21 ngày
sau tiêm đều cho kết quả dương tính. Như vậy vắc xin vô hoạt đã kích thích sản sinh kháng thể kháng PRRS trên lợn.
Đồng thời quá trình kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phương pháp Elisa, chung tôi tiến hành kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phương pháp IPMA tại các lô thí nghiệm, kết quả thí nghiệm được thể hiện tại bảng sau:
Bảng 4.22. Kết quả kiểm tra hàm lƣợng kháng thể bằng phƣơng pháp IPMA
Lô vắc
xin Nhóm
Hiệu giá IPMA Tỷ lệ dƣơng tính bảo hộ 0dpi 21dpi PR1-0119 Thí nghiệm 1 1/80 1/1280 100% 2 1/40 1/640 3 1/40 1/2560 4 1/80 1/1280 5 1/40 1/1280 Đ/C 1 1/80 1/160 2 1/40 1/160 3 1/40 1/80 PR1-0119 Thí nghiệm 1 1/40 1/1280 100% 2 1/80 1/2560 3 1/80 1/640 4 1/160 1/1280 5 1/80 1/640 Đ/C 1 1/40 1/160 2 0 1/160 3 1/80 1/80 PR1-0219 Thí nghiệm 1 1/80 1/1280 100% 2 1/40 1/640 3 1/40 1/2560 4 1/80 1/1280 5 1/40 1/1280 Đ/C 1 0 1/40 2 1/80 1/160 3 1/40 1/80
Từ kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phương pháp IPMA cho thấy những lợn đối chứng đều có hàm lượng kháng thể kháng PRRS ở mức thấp, dưới mức bảo hộ (IPMA ≥1/640 (TCVN 8685-13:2014 2014)) trong khi đó ở lô thí nghiệm tại thời điểm 21 ngày sau khi tiêm có tỷ lệ dương tính bảo hộ (IPMA ≥1/640 (TCVN 8685-13:2014 2014) 100% trên các lô thí nghiệm.
1/40 1/80
1/160 1/320
1/640 1/1280
1/2560 1/5120
Hình 4.12. Hình ảnh kiểm tra IPMA
Từ kết quả xác định hàm lượng kháng thể kháng VIRUS PRRS bằng phương pháp ELISA và IPMA, chúng tôi tiếp tục đánh giá hiệu lực của vắc xin
vô hoạt PRRS bằng phương pháp công cường độc, 21 ngày sau khi tiêm sau khi tiêm mũi 2, tiến hành công cường độc bằng chủng virus PRRS cường độc phân lập tại Việt Nam cho lợn ở 2 lô thí nghiệm và đối chứng (chủng KTY-PRRS-01 với liều công là 100 TCID50) (Phạm Văn Sơn, 2018).
Sau khi công cường độc, theo dõi lợn thí nghiệm về triệu chứng lâm sàng, đo thân nhiệt hàng ngày và theo dõi tình trạng ăn uống của lợn trong 21 ngày. Lợn được mổ khám sau 21 ngày thí nghiệm để đánh giá các biến đổi bệnh lý.
Theo dõi các triệu chứng lâm sàng và các biểu hiện phản ứng cục bộ của lợn ở các lô trong thời gian 21 ngày sau khi công cường độc. Kết quả thể hiện ở bảng 4.23.
Bảng 4.23. Kết quả đánh giá công cƣờng độc
STT Nhóm Triệu chứng lâm sang
Lô 0118
TN Lợn ăn uống bình thường, có biểu hiện mệt mỏi nhưng trở lại bình thường sau 2 – 3 ngày.
Đ/C Lợn sốt cao, chảy nước mũi, ho, sưng mí mắt Lô 0119
TN Lợn sau khi công cường độc 12h có phản xạ chậm chạp, sốt nhẹ (39,5 0C), 2-3 ngày sau hoạt động bình thường
Đ/C Lợn sốt cao, bỏ ăn, ít vận động, ho TN Lợn sốt nhẹ (390C), ăn uống bình thường Lô 0219
Đ/C
Lợn bỏ ăn, sốt cao (40 - 41,50C), mệt mỏi, ít vận động, da nổi mẩn đỏ vùng da mỏng, khó thở.
Từ bảng 4.23 cho thấy cả 3 lô vắc xin với những lợn thí nghiệm được tiêm vắc xin sau 21 ngày sau khi Công cường độc toàn bộ lợn khỏe mạnh không biểu hiện triệu chứng bệnh tích của PRRS tỷ lệ bảo hộ đạt 100%.. Ở lô đối chứng tất cả lợn ốm nặng (với biểu hiện lâm sàng: bỏ ăn, sốt cao, tiêu chảy…). Tổn thương đại thể điển hình nhất ở phổi và hạch lympho, hạch lympho sung huyết, xuất huyết kết hợp hoại tử (hạch dưới hàm, hạch bẹn nông, hạch ruột, hạch phổi…), viêm phổi kẽ. Các tổn thương được quan sát thấy khi mổ khám lợn hoàn toàn giống với các tổn thương ở lợn mắc PRRS tự nhiên đã được một số nghiên cứu trước đây công bố (Nguyễn Thị Lan, 2012).
Để có thêm thông tin trong nghiên cứu hiệu lực của vắc xin, chúng tôi tiến hành mổ khám để kiểm tra bệnh tích lợn chết trong thời gian thí nghiệm hoặc khi đã hết 21 ngày thí nghiệm.
Bệnh tích của lợn thí nghiệm được chúng tôi tổng hợp như sau:
Lợn ở nhóm không được tiêm vắc xin: Bệnh tích đặc trưng thấy chủ yếu ở phổi và hạch lympho. Toàn bộ nhóm lợn này phổi bị viêm rất nặng, có những
đám viêm lan tràn nên làm cho phổi có màu đỏ, xám, chắc, đặc. Lợn ở nhóm được tiêm vắc xin không thấy biến đổi trên các cơ quan tổ chức của lợn.
Một số hình ảnh mổ khám trên lợn
Lợn trước khi công cường độc Lợn sau khi công cường độc
Hình 4.14. Biến đổi thân nhiệt của lợn sau khi công cƣờng độc
Từ kết quả đánh giá công cường độc, đánh giá hiệu giá kháng thể hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp bằng phản ứng ELISA và bằng phản ứng IPMA tham chiếu với tiêu chuẩn TCVN 8685-13:2014 quy trình kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt phòng bệnh hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) (TCVN 8685-13:2014 2014) vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn đạt chỉ tiêu hiệu lực thành phẩm.
Tổng kết các thí nghiệm kiểm nghiệm vắc xin thành phẩm vô hoạt phòng hội chửng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn được sản xuất quy mô công nghiệp đạt yêu cầu chất lượng theo quy định tại TCVN 8685-13:2014 (TCVN 8685- 13:2014 2014). 37 37.5 38 38.5 39 39.5 40 40.5 41 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
BIẾN ĐỔI THÂN NHIỆT CỦA LỢN SAU CÔNG CƯỜNG ĐỘC
PR1-0118 TN PR 1-0119 TN PR1-0219 TN
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
5.1.1. Hoàn thiện quy trình sản xuất vắc xin phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trên hệ thống chai roller với quy mô 100 lít kháng nguyên/mẻ.
- Nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống chai roller tối ưu trong điều kiện không CO2 với lượng tế bào ra ban đầu là 1x105 Cells/ml, sau 72h cấy chuyển tế bào 1 lần và tốc độ lăn 0,2 đến 0,3 rpm.
- Liều gây nhiễm thích hợp nhất đối với virus hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp chủng KTY - PRRS - 01 trên môi trường nuôi cấy tế bào Marc - 145 là: 104 TCID50.
- Thời gian thu hoạch huyễn dịch virus PRRS thích hợp nhất, hàm lượng virus cao, chất lượng tốt là sau khi gây nhiễm virus 72 giờ.
- Bất hoạt, nhũ hóa vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng PRRS, sản xuất thành công 03 lô liên tiếp quy mô tối thiểu 20.000 liều/mẻ.
- Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp được bất hoạt theo quy trình thích hợp bằng BEI tại nồng độ 1mM trong 24h tại 370C, hiệu giá virus trước khi bất hoạt 108 TCID50/ml và nhũ hóa bằng dầu khoáng ISA 201 VG. 5.1.2. Kiểm nghiệm vắc xin phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn theo quy mô công nghiệp. Vắc xin sản xuất ra đạt chất lượng theo tiêu chuẩn TCVN 8685-13:2014.
- Vắc xin đạt cảm quan, không lắng cặn, không đông vón, màu trắng sữa - Vắc xin đạt yêu cầu vô trùng, không bị tạp nhiễm vi khuẩn và nấm mốc - Vắc xin đạt yêu cầu an toàn khi tiêm gấp 2 liều sử dụng
- Văc xin đạt yêu cầu hiệu lực khi đánh giá bằng cả 3 chỉ tiêu ELISA, IPMA và công cường độc.
5.2. KIẾN NGHỊ
- Tiến hành thử nghiệm vắc xin ngoài thực địa nhằm đánh giá hiệu lực việc sử dụng vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn.
- Đánh giá độ dài miễn dịch của lợn sau khi tiêm vắc xin, xác định thời gian tái chủng phù hợp.
- Nghiên cứu hạn sử dụng của vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trong điều kiện lão hóa cấp tốc, điều kiện khắc nghiệt.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng Việt:
1. Bộ Khoa học Công nghệ (2014). TCVN 8685-13:2014 Quy trình kiểm nghiệm - phần 13: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS). Việt Nam: 7.
2. Bộ Y Tế (2018). Nguyên tắc, tiêu chuẩn thực hành tốt sản xuất thuốc của tổ chức y tế thế giới. 35/2018/TT-BYT. B. Y. Tế.
3. Chăn nuôi Việt Nam. (2018). Thống Kê Chăn Nuôi Việt Nam 01/10/2018. Truy cập 20/03/2019, 2019 tại http://channuoivietnam.com/thong-ke-chan-nuoi/.
4. Cục Thú Y (2007). Báo cáo tình hình dịch bệnh trên lợn ở các tỉnh đồng bằng Sông Hồng.
5. Cục Thú Y (2018). Báo cáo tổng kết Cục thú y 2018.
6. Feng Y., T. Zhao, N. Tùng, K. Inui, Y. Ma, N. T. Hoa, Nguyễn Văn Cảm, D. Liu, Bùi Quang Anh, Tô Long Thành, C. Wang, K. Tian and G. F. Gao (2009). "Các biến chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp tại Việt Nam và Trung Quốc năm 2007". Khoa học thú y. XVI (1).
7. Kamakawa A., Hồ Thị Viết Thu và S. Yamada (2006). "Epidemiological survey of viral diseases of pigs in the Mekong delta of Vietnam between 1999 and 2003." Vet Microbiol. 118(1-2).tr. 47-56.
8. Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương (2010). Miễn Dịch Học Ứng Dụng. Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội.
9. Nguyễn Ngọc Tiến (2011). "Tình hình dịch lợn tai xanh (PRRS) ở Việt Nam và công tác phòng chống dịch". Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y. 1.tr. 18.
10. Nguyễn Lương Hiền và Ngô Thành Long., (2001). Bước đầu khảo sát hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở một số trại heo giống thuộc vùng thành phố Hồ Chí Minh. Báo cáo khoa học, phần chăn nuôi thú y 1999-2000.tr. 224-227.
11. Nguyễn Bá Hiên, Trần Xuân Hạt, Phạm Quang Thái, Hoàng Văn Năm., (2010). Công nghệ chế tạo và sử dụng vắc xin thú y. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội. 12. Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2013), Bệnh truyền nhiễm của động vật
nuôi và biện pháp khống chế. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
13. Nguyễn Thị Lan (2012). "Đặc điểm bệnh lý Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) ở lợn con sau cai sữa và lợn choai và xác định bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang". Tạp chí Khoa học Kỹ thuật thú y. 19 (3).
14. Phạm Văn Sơn (2018). Nghiên cứu tạo giống gốc và thử nghiệm sản xuất vacxin