Phần 3 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại công ty TNHH MTV Avac Việt Nam.
3.3. NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƢỢNG SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU
3.3.1. Đối tƣợng, vật liệu
- Giống vắc xin phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn được cung cấp từ đề tài KC.04.15/11-15 chủng KTY-PRRS-01, hiệu giá virus giống gốc đạt 3.03x106 TCID50 /ml (Phạm Văn Sơn và cs., 2017).
3.3.2. Hóa chất bất hoạt
- BEI (Binary Ethylenimine) - Formaldehyde 35%
3.3.3. Chất bổ trợ
- Nhũ dầu khoáng kép MONTANIDETM ISA 201 VG
3.3.4. Các loại dung dịch, môi trƣờng
3.3.4.1. Môi trường cho quá trình nuôi tế bào Marc – 145 và nhân virus PRRS
- PBS 1X (Phosphate Buffered Saline) - Penicillin/Streptomycin
- DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)
- Trypsin-EDTA
- FBS (Fetal Bovin Serum), NBCS (Newborn Calf Serum) Đệm Hepes
3.3.4.2. Môi trưri s PRRS Goat PAb to
- TSB (Trypticase Soybean) - TSA (trypticase soy agar) - SD ( sabouraud dextrose agar) - Canh thang PPLO
- XLD (Xylose Lysine
Deoxycholate)
- FTM (fruit thioglycolate agar) - Thạch máu
3.3.4.3. Môi trường, hóa chất cho thử nghiệm IPMA - Thuốc khử trùng: Virkon, Chloroform - PBS 1X (Phosphate Buffered Saline) - Penicillin/Streptomycin
- DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)
- FBS (Fetal Bovin serum) - Acetyl Ethyl Carbazole (AEC) - H2O2 Hydrogen peroxide 30% - Tween 80 - Dimethylformamide (DMEF) - Formaldehyde 37 % - Virus PRRS - Nonidet P40 Substitute - Sodium acetate
- Glacial acetic acid - Trypsin
- Trypan blue - Skim milk powder
- Thuốc khử trùng: Virkon 1% hoặc Chloramine 2-3%, Chloroform. - Tế bào Marc - 145
- Huyết thanh đối chứng dương - Huyết thanh đối chứng âm
- Conjugate: Goat PAb to Pig IgG (HRP) ab102135 1mg/1ml (Ab cam)
3.3.4.4. Môi trường thực hiện phản ứng Elisa phát hiện kháng thể PRRS
- Nước cất hoặc nước đã khử khoáng - Môi trường phát triển tế bào DMEM có chứa FBS (huyết thanh bào thai bê)
- Formalin 37%
- Sữa gầy (skim milk) - Dung dịch NP40
- Dung dịch peroxidase (H2O2) 30% - Dung dịch AEC
3.3.4.5. Môi trường sử dụng kiểm tra vô hoạt virus trong sản xuất vắc xin
- Môi trường DMEM đã bổ sung 2% FBS, 100 UI penicillin và 100µg streptomycin/1ml
- Dung dịch PBS 1X (Photphat Buffer Saline), Trypsin-EDTA - Huyết thanh bào thai bê FBS (Fetal bovine serum)
3.3.5. Trang thiết bị, dụng cụ
3.3.5.1 Trang thiết bị
- Tủ an toàn sinh học cấp 2 - Máy ly tâm lạnh
- Tủ lạnh âm sâu 800C, tủ lạnh âm 400C - Hệ thống chai lăn tế bào
- Phòng ấm có hệ thống cung cấp CO2 - Tủ ấm 37, tủ ấm CO2
- Water bath
- Máy bơm hút chân không - Tank bất hoạt vắc xin - Tank nhũ hóa vắc xin.
- Hệ thống chia liều – Viền nắp tự động.
- Máy cất tế bào
- Cân phân tích
- Nồi hấp tiệt trùng (Autoclave)
- Máy đọc ELISA Elx800 đọc được bước sóng từ 605nm-630 nm
- Máy Voltex - Máy phá vỡ tế bào - Bể ổn nhiệt (water bath) - Kính hiển vi soi ngược - Kính hiển vi thường
- Pipette điện tự động
- Máy lọc tiếp tuyến TFF
- Pipettes: 10-100µl, 100-1000 µl, Multi Pipettes 10-100 µl. 50-200 µl
3.3.5.2. Dụng cụ
- Chai roller, T75, T225 nuôi tế bào - Chai thủy tinh trung tính dung tích
100 ml, 200 ml, 500 ml và 1000 ml - Ống đong thủy tinh, dung tích 50
ml, 100 ml, 200 ml, 500 ml và 1000 ml
- Micropipet đơn kênh, dung tích từ 0,5 l đến 10 l, từ 20l đến 200l, từ 100 l đến 1000 l - Pipet 8 kênh (30-300l) - Ống nghiệm vô trùng: ống eppendorf 1,7ml- 2ml - Lam kính đếm tế bào - Tip 200 µl, 100 µl có lọc, Tip 200 µl, 100 µl - Máng - Tube 50ml, 15ml - Lọc 0.45 µm, lọc 0.22 µm - Đĩa 96 giếng nuôi cấy tế bào - Chai T75, T25, T175 và T225 - Ống 1.5ml (eppendorf)
- Pipette 15ml, 20ml
- Găng tay, khẩu trang, giấy lau - Dụng cụ chứa rác thải
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1. Nghiên cứu sản xuất vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn quy mô công nghiệp loạn sinh sản và hô hấp ở lợn quy mô công nghiệp
3.4.1.1. Nghiên cứu quy trình sản xuất kháng nguyên virus PRRS trên hệ thống chai roller
3.4.1.2. Nghiên cứu quy trình bất hoạt kháng nguyên, sản xuất bán thành phẩm vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 3.4.1.3. Kiểm tra trong quá trình sản xuất (IPC)
3.4.2. Kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn ở quy mô công nghiệp sản và hô hấp ở lợn ở quy mô công nghiệp
3.4.2.1. Kiểm tra cảm quan 3.4.2.2. Kiểm tra thuần khiết 3.4.2.3. Kiểm tra an toàn 3.4.2.4. Kiểm tra hiệu lực
3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Quy trình tóm tắt sản xuất vắc xin PRRS trên quy mô công nghiệp
Quy trình sản xuất vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loại sinh sản và hô hấp ở lợn là quy trình khép kín, toàn bộ quá trình sản xuất, kiểm tra trong quá trình và kiểm nghiệm đều được kiểm soát nghiêm ngặt, tuân thủ chặt chẽ các yêu cầu của tiêu chuẩn GMP-WHO về sản xuất chế phẩm sinh học vô trùng trong đó đặc biệt là chỉ tiêu vô trùng và an toàn. Vì vậy, các nguyên liệu đưa vào để phục vụ sản xuất vắc xin phải được lựa chọn kỹ lưỡng, đúng tiêu chuẩn, đồng thời tỷ lệ của các chất đưa vào vắc xin cũng phải thích hợp. Trên cơ sở đó, vắc xin sản xuất ra mới đảm bảo chất lượng.
Nhân giống sản xuất
Hình 3.1. Sơ đồ sản xuất vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp theo quy mô công nghiệp
3.5.2. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào
3.5.2.1. Hồi phục tế bào từ nguồn giống bảo quản ở lạnh sâu
- Chuẩn bị 5ml môi trường DMEM 5% FBS, làm ấm trong tủ ấm 37o
C 30 phút trước khi mở giống, cốc nước ấm và dụng cụ kèm theo.
- + Bước 1 Đông tan: lấy 1 ống tế bào ra khỏi nitơ lỏng, đặt vào cốc nước sạch 370C, chuyển vào phòng làm tế bào, chờ tan đông.
Ra chai, hoàn thiện sản phẩm Cô đặc kháng nguyên (hiệu giá tối
thiểu 108 TCID50/ml)
Bất hoạt virus (trên tank bất hoạt)
Nhũ hóa, bổ sung chất bổ trợ (trên tank nhũ hóa – phối trộn
Gây nhiễm virus (20 ml/chai roller 2X) Giống gốc vắc xin
chủng KTY-PRRS-
01 Nhân giống tế bào phục
vụ sản xuất. (300-500 chai roller 2X)
Thu hoạch huyễn dịch virus (100 lít kháng nguyên/mẻ)
Kiểm nghiệm thành phẩm (cảm quan, an toàn, vô trùng, hiệu lực).
- + Bước 2 Cân bằng môi trường: dùng pipette hút 5ml môi trường DMEM 5% FBS vào ống li tâm. Sau đó hút chuyển huyễn dịch tế bào từ ống tế bào đã giải đông sang ống li tâm đã có 5ml DMEM 5% FBS rồi trộn đều.
- + Bước 3 Ly tâm loại bỏ dung dịch bảo quản: ly tâm 700 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ phẩn dung dịch ở trên (giữ lại cặn tế bào màu trắng).
- + Bước 4 Hòa tan trong môi trường nuôi cấy tế bào: thêm vào ống ly tâm môi trường DMEM 5% FBS, dùng pipette nhẹ nhàng hút lên xuống nhiều lần để hòa tan tế bào.
- + Bước 5 Cấy tế bào vào chai nuôi: ghi thông tin trên chai (Ngày mở giống, đời tế bào, lô). Hút môi trường DMEM 5% FBS vào chai tế bào (cho vào phía đáy chai nuôi tế bào). Chuyển tế bào vào chai tế bào, lắc nhẹ chai.
- Quan sát trên kính hiển vi.
- + Bước 6 Theo dõi tế bào phát triển và thay môi trường nuôi cấy tế bào: nuôi ở 37oC, 5% CO2 (hoặc môi trường DMEM có bổ sung chất ổn định pH) Theo dõi sự phát triển của tế bào trên kính hiển vi (thay môi trường 3 ngày 1 lần nếu thấy cần thiết) cho đến khi tế bào phủ kín bề mặt đáy chai nuôi.
3.5.2.2. Nuôi cấy tế bào MARC- 145
- Xác định số chai tế bào cần nhân, lượng môi trường đầy đủ và không đầy đủ, lượng PBS, trypsin, và cân bằng ở 37oC trước khi tiến hành thí nghiệm. - Khi bình nuôi tế bào đã có độ phủ kín hơn 90% bề mặt, tách tế bào và cấy
chuyển như sau:
- + Bước 1 Loại bỏ môi trường đang nuôi: lắc nhẹ chai nuôi tế bào để làm sạch tế bào chết. Dùng pipette/máy hút chân không hút bỏ môi trường trong chai nuôi tế bào. Rửa tế bào đang nuôi 2 lần với PBS: Thêm vào chai nuôi tế bào PBS, lắc nhẹ chai, hút bỏ PBS.
- + Bước 2 Trypsin hóa tách tế bào: hút trypsin vào chai nuôi tế bào, sau đó lắc nhẹ nhàng để trypsin bám đều mặt tế bào. Đặt vào tủ 37oC, ủ vừa đủ 10-15 phút để làm các tế bào tách khỏi thành đáy chai.
- + Bước 3 Trung hòa trypsin bằng DMEM 5% FBS: sau khi tế bào đã tách nhau hoàn toàn, trung hòa trypsin bằng DMEM 5% FBS. Thêm vào chai môi trường DMEM 5% FBS (bằng lượng trypsin sử dụng) để dừng quá trình trypsin hóa, trộn đều, chuyển sang ống li tâm tương ứng.
- + Bước 4: loại bỏ trypsin: ly tâm 700 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ phần dung dịch ở trên, giữ cặn tế bào màu trắng.
- + Bước 5 Cân bằng môi trường và đếm số tế bào: hòa tan cặn tế bào trong môi trường DMEM 5% FBS. Đếm số tế bào: Hút 100µl huyễn dịch tế bào trong 100 µl Trypan Blue. Đếm tổng số tế bào ở 4 góc và tính lượng tế bào có trong 1ml huyễn dịch.
- Công thức tính số tế bào có trong 1ml dung dịch:
- Tổng số tế bào/1ml = tổng số tế bào đếm được/số ô đếm x 2 x 104
- + Bước 6 Cấy chuyển tế bào: đánh dấu bình nuôi tế bào mới (tên dòng tế bào, ngày nuôi cấy, lần cấy chuyển). Pha loãng tế bào đến mật độ mong muốn trong môi trường DMEM 5% FBS. Chia đều huyễn dịch tế bào vào chai nuôi đã chuẩn bị sẵn: 6ml/chai T25, 20ml/chai T75, 120 ml cho chai roller 1X và 200- 250 ml cho chai roller 2X hoặc đĩa 96 giếng 100µl/giếng.
- + Bước 7 Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển: theo dõi sự phát triển của tế bào hàng ngày.
3.5.2.3. Phương pháp thu và b vng pháphát t
+ Các bước thu tế bào giống với các bước cấy chuyển tế bào chỉ khác ở bước 5 và bước 6.
+ Bước 5: chia ống tế bào, pha loãng tế bào từ 2 đến 5x106 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ có bổ sung 10% DMSO, chia huyễn dịch tế bào vào các ống bảo quản 1ml/ống.
- + Bước 6: bảo quản tế bào, giữ ống tế máy cất giống tế bào, sau đó chuyển tế bào vào giữ trong nitơ lỏng.
3.5.3. Phƣơng pháp gây nhiễm, thu hoạch và chuẩn độ virus PRRS
3.5.3.1. Phương pháp gây nhiễm và thu hoạch virus
- Khi tế bào đã phát triển đầy bề mặt chai nuôi cấy (hơn 90%) tạo thành tế bào một lớp thì tiến hành gây nhiễm tế bào.
- + Bước 1 Chuẩn bị huyễn dịch virus 10% : đông tan huyễn dịch virus 10% bảo quản - 800
C.
- + Bước 2 Rửa tế bào: lấy chai tế bào ra,lắc nhẹ chai. Sau đó, dùng pipette hút bỏ môi trường trong chai tế bào. Rửa tế bào 2 lần bằng PBS, Lắc nhẹ chai, hút bỏ PBS
- + Bước 3 Gây nhiễm tế bào: Chai đối chứng: Cho DMEM vào chai.
- Chai gây nhiễm: Chuyển huyễn dịch virus vào chai tế bào đã rửa sạch. Lắc nhẹ để huyễn dịch virus láng đều mặt tế bào. Ủ 370C trong 30 phút đến 1 giờ. - + Bước 4 Bổ sung môi trường: Sau khi ủ 30 phút đến 1 giờ, bổ sung vào chai
tế bào gây nhiễm môi trường DMEM 2% FBS.
- + Bước 5 Theo dõi CPE hàng ngày: nuôi 370C theo dõi CPE trong 3-4 ngày. Khi trên 90 % tế bào có CPE tiến hành thu virus.
- + Bước 6 Thu virus: đưa chai tế bào bảo quản tủ -400C, đợi dịch trong chai đông hoàn toàn, mang ra ngoài môi trường rã đông nhanh (đông tan) hoặc sử dụng máy phá vỡ tế bào. Thu huyễn dịch virus vào ống li tâm, li tâm 4000 vòng trong 10 phút ở 40
C. Thu dịch nổi vào chai đựng huyễn dịch virus, chai đựng huyễn dịch được giữ trong tủ - 400
C.
3.5.3.2. Chuẩn độ virus
Tế bào MARC-145 được chuẩn bị trên khay 96 giếng (5.0×104 tế bào/giếng). Virus được pha loãng theo cơ số 10 từ 10-1 – 10-8 rồi đem ủ trên bề mặt tế bào một lớp của các giếng theo thứ tự đánh dấu trước (25µl/giếng), mỗi độ pha loãng gây nhiễm cho 12 giếng tế bào. Sau 1 giờ ủ, dung dịch duy trì DMEM có chứa 2% FBS được bổ sung vào (100µl/giếng) trong suốt thời gian theo dõi không thay môi trường nuôi cấy.
CPE được quan sát hàng ngày từ ngày thứ 1 cho đến ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm.
TCID50 được xác định theo phương pháp của Spearman Kaber. Lg TCID50 = (Xo + d/2) - d × (∑ri/n)
Trong đó: Xo là lg của bậc pha loãng virus cao nhất d: là lg của bậc pha loãng ri: là số giếng tế bào âm tính ở mỗi bậc pha loãng
n: là số giếng tế bào được gây nhiễm ở mỗi bậc pha loãng.
3.5.4. Phương pháp cô đặc, vô hoạt, nhũ hóa và kiểm tra sau nhũ hóa vắc xin
3.5.4.1. Phương pháp cô đặc virus bằng máy lọc tiếp tuyến TFF
- Bước 1: Kết nối bộ cấp dịch cần cô đặc vào cột lọc (từ tank, hoặc bình), đường hồi, dịch cần cô đặc.
cô đặc (2X, 5X, 10X, 20X ...). - Bước 3: Tiến hành chạy máy
- Bước 4: Dừng máy, thu dịch sau khi cô đặc.
3.5.4.2. Phương pháp vô hoạt virus bằng BEI
- Virus vắc xin PRRS thu hoạch từ môi trường tế bào Marc 145 được lọc, cô đặc và vô hoạt bằng BEI (Bahnemann 1990) như sau.
- Bất hoạt tại nồng độ 1mM BEI trong 24 giờ tại 37 0C.
- Sau 24h trung hòa lượng BEI bằng Na-thiosulphate (Na2S2O3) trong 2h tại 370C.
- Thu hoạch kháng nguyên và kiểm tra kháng nguyên sau bất hoạt bằng phương pháp phân lập lại virus sau bất hoạt trên môi trường Marc – 145.
3.5.4.3. Bằng formaldehyde
- Virus vắc xin PRRS thu hoạch từ môi trường tế bào Marc - 145 được lọc, cô đặc và vô hoạt bằng formalin như sau
- Bất hoạt virus tại nồng độ 0,3% trong 24 giờ tại 37 0C.
- Sau 24h trung hòa lượng formaldehyde còn tồn dư bằng L-glutamin 0,2% với tỉ lệ 1:1.
- Thu hoạch kháng nguyên và kiểm tra kháng nguyên sau bất hoạt bằng phương pháp phân lập lại virus sau bất hoạt trên môi trường Marc – 145.
3.5.4.4. Phương pháp nhũ hóa vắc xin
- Nhũ hóa bằng nhũ dầu khoáng kép MontanideTM ISA 201VG (nhũ kép) của hãng Seppic (Pháp)
- Tỷ lệ kháng nguyên: Nhũ dầu khoáng kép 1:1 (một phần huyễn dịch vắc xin với 1 phần nhũ dầu khoáng kép).
- Phối trộn vắc xin (kháng nguyên và chất bổ trợ) thực hiện trên tank nhũ hóa vắc xin chuyên dụng với quy trình như sau:
- + Bước 1: cấp dầu khoáng kép ISA 201VG đã tiệt trùng vào tank nhũ hóa, khuấy nhẹ nhàng ít nhất 20 phút.
- + Bước 2. cấp kháng nguyên theo tỷ lệ 1:1, vừa cấp kháng nguyên vừa tiếp tục khuấy đến khi quan sát thấy huyễn dịch đồng nhất.
- + Bước 3. Tạo nhũ bằng máy khuấy chuyên dụng tại tốc độ 600 - 8.00 vòng/phút trong 20-30 phút.
3.5.4.5. Phương pháp kiểm tra sau nhũ hóa vắc xin
- Kiểm tra sự ổn định và đồng nhất: Sử dụng bơm tiêm 1 ml nhỏ mẫu vào ống môi trường TSB, yêu cầu giọt vắc xin không tan vào môi trường TSB.
- Lấy 40 ml virus vắc xin sau nhũ hóa cho vào 04 ống fancol 15, ly tâm 02 ống