4.1.2. Tối ƣu hóa quy trình gây nhiễm, thu hoạch virus PRRS trên hệ thống chai roller
4.1.2.1. Xác định liều gây nhiễm virus
Chúng tôi thực hiện sản xuất huyễn dịch virus từ giống virus KTY-PRRS- 01 từ đề tài KC.04.15/11-15 (có hiệu giá virus giống ban đầu 3,03x106 TCID50 /ml) để thực hiện sản xuất vắc xin. Lượng virus thu được trong quá trình sản xuất liên quan chặt chẽ đến liều virus gây nhiễm và thời gian thu hoạch virus. Để xác định liều điều này chúng tôi đã tiến hành gây nhiễm virus lên chai roller 2X có tỷ lệ tế bào bám đáy khoảng 90% đến 100%. Với liều gây nhiễm chúng tôi thực hiện từ liều 102 TCID50/ml đến 106 TCID50/ml, gây nhiễm 20ml huyễn dịch virus/chai roller 2X, sau khi xuất hiện bệnh tích tế bào (CPE) đạt từ 90% đến
100%, chúng tôi tiến hành thu hoạch virus bằng máy phá vỡ tế bào và thu virus chuyên dụng. Huyễn dịch virus sau thu hoạch được kiểm tra hiệu giá virus, Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 4.5. như sau:
Bảng 4.5.Kết quả xác định liều gây nhiễm thích hợp của virus PRRS chủng KTY-PRRS1 trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào
Hiệu giá virus
Liều gây nhiễm
102 TCID50 /ml 103 TCID50/ml 104 TCID50/ml 105 TCID50/ml 106 TCID50/ml Nồng độ pha loãng virus 3x10 -5 3x10-4 3x10-3 3x10-2 3x10-1 Số chai thí nghiệm 5 5 5 5 5 Thời gian xuất hiện CPE 100% 96 84 72 48 36 Hiệu giá virus 10 6,2 106,8 107,3 107,2 106,8
Từ bảng 4.5. cho thấy ở các liều gây nhiễm khác nhau thì thời gian xuất hiện bệnh tích tế bào và bị phá hủy hoàn toàn (CPE 100%) cũng khác nhau, hiệu giá virus khác nhau.
Ở lô đối chứng: các chai đối chứng không gây nhiễm virus, theo dõi đến 120 giờ, tế bào vẫn nguyên vẹn, nhưng đã có tế bào già bong ra khỏi thành chai nuôi. Tuy nhiên, tế bào vẫn phủ kín diện tích mặt nuôi.
Ở liều gây nhiễm 102
TCID50 thì sau 48 giờ bắt đầu xuất hiện bệnh tích tế bào và tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 96 giờ gây nhiễm virus.
Ở liều gây nhiễm 103 TCID50 cũng thì sau 48 giờ bắt đầu xuất hiện bệnh tích tế bào thời gian tế bào bị phá hủy hoàn toàn đã rút ngắn xuống 84 giờ. Ở thời điểm này bệnh tích tế bào rõ rệt, môi trường nuôi cấy còn chất dinh dưỡng, chưa chuyển màu.
Ở liều gây nhiễm 104
TCID50 bệnh tích tế bào xuất hiện sớm nhất là 36 giờ sau khi gây nhiễm virus và đến 72 giờ tế bào bị phá hủy hoàn toàn.
Ở liều gây nhiễm 105 TCID50 và 106 TCID50 bệnh tích tế bào xuất hiện sớm nhất là 24 giờ sau khi gây nhiễm virus và đến 48 giờ tế bào bị phá hủy hoàn toàn
Huyễn dịch virus thu được ở các nồng độ pha loãng khác nhau sau khi gây nhiễm virus (thu hoạch ở thời điểm có CPE 100%) được chuẩn độ xác định hiệu giá virus Hiệu giá virus thu được cho thấy ở liều gây nhiễm 104 TCID50 cho hiệu giá virus cao nhất (107,3 TCID50/ml) và thấp nhất ở nồng độ 102 TCID50 (106,2 TCID50/ml).
Các kết quả thí nghiệm ngày phù hợp với nghiên cứu đặc tính sinh học của chủng virus vắc xin KTY-PRRS-01 của Phạm Văn Sơn và cộng sự (Phạm Văn Sơn và cs., 2017).
CPE virus PRRS Đối chứng