Phần 3 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
3.5.5.Kiểm tra thành phẩm vắc xin
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.5.Kiểm tra thành phẩm vắc xin
3.5.5.1. Phương pháp kiểm tra cảm quan, tính chất vật lý vắc xin vô hoạt
- Kiểm tra bằng mắt thường để xác định màu sắc của vắc xin trong môi trường ánh sáng trắng tối thiểu 500 Lux – 1000 Lux. Kiểm tra tính chất nhũ vắc xin theo mục 3.5.4.5.
- Yêu cầu cảm quan vắc xin đồng nhất, không lắng cặn, không đông vón, màu trắng sữa.
- pH vắc xin: từ 6,8 – 7,2.
3.5.5.2. Phương pháp kiểm tra vô trùng (theo TCVN 8684:2011)
a, Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn hiếu khí
- Tiến hành cấy mẫu vắc xin trên 2 ống môi trường kiểm tra sau đây: Tryptone soy Broth và môi trường Tryptone soy Agar , 2 đĩa môi trường thạch máu, lượng vắc xin cấy từ 1% đến 2% (phần thể tích) so với môi trường kiểm tra. - Ủ môi trường đã cấy trong tủ 37 0
C, theo dõi từ 7 ngày đến 10 ngày.
- Mẫu vắc xin được xem là đạt tiêu chuẩn khi không có bất cứ vi sinh vật nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.
b, Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn yếm khí
- Tiến hành cấy mẫu vắc xin trên 2 ống môi trường kiểm tra sau đây: Fluid Thioglycolate Medium lượng vắc xin cấy từ 1% đến 2% (phần thể tích) so với môi trường kiểm tra.
- Ủ môi trường đã cấy trong tủ 37 0C, theo dõi từ 7 ngày đến 10 ngày.
- Mẫu vắc xin được xem là đạt tiêu chuẩn khi không có bất cứ vi sinh vật nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.
c, Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc
- Mẫu vắc xin được ria cấy trên môi trường thạch Sabouraud hoặc môi trường thủy phân casein đậu tương. Theo dõi 14 ngày ở nhiệt độ phòng (từ 20 0C đến 25 0C). Mẫu vắc xin được xem là đạt tiêu chuẩn khi không có bất cứ tạp khuẩn nấm mốc nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.
d, Kiểm tra tạp nhiễm Salmonella
- Mẫu vắc xin được cấy trên môi trường kiểm tra, dùng một trong các loại môi trường sau: thạch MacConkey, thạch Salmonella-Shigella, thạch Brilliant Green, thạch Desoxycholat xitrat hoặc XLD, với nồng độ từ 1% đến 2% dung tích môi trường kiểm tra. Ủ môi trường đã cấy vắc xin trong tủ ở 37oC, theo dõi từ 18h đến 24h sau đó cấy chuyển tiếp sang ống môi trường nước, dùng một trong các loại môi trường sau: canh thang selenit hoặc canh thang tetrathionat. Ủ trong tủ ở 370C, theo dõi đến 48h đến 72h. Mẫu vắc xin được xem là đạt khi không có vi khuẩn Salmonella mọc trên các loại môi trường kiểm tra
e, Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma
- Mẫu virus vắc xin được cấy kiểm tra trên môi trường canh thang PPLO với nồng độ từ 1 % đến 2 % trong 100 ml môi trường và trên đĩa thạch PPLO có bổ sung huyết thanh ngựa và chất chiết nấm men với thể tích 0,1 ml vắc xin trên 1 đĩa.
- Theo dõi môi trường lỏng trong 14 ngày ở nhiệt độ từ 330C đến 370C. Tại các thời điểm 3 ngày, 7 ngày, 10 ngày và 14 ngày, lấy canh khuẩn ở môi trường lỏng trên ria cấy vào môi trường thạch PPLO (2 đĩa). Ủ trong tủ ấm CO2 ở 370C có 5 % khí CO2, theo dõi trong 28 ngày.
- Mẫu virus vắc xin được xem là đạt khi không có khuẩn lạc Mycoplasma
3.5.5.3. Phương pháp kiểm tra an toàn vắc xin (theo TCVN 8685-13:2014)
- Sử dụng 5 lợn mẫn cảm, khỏe mạnh, không có kháng thể PRRS, lợn được tiêm mỗi con 2 liều vắc xin. Theo dõi lợn trong 21 ngày. Vắc xin được coi là đạt nếu tất cả lợn phải sống khỏe mạnh, không có bất cứ phản ứng cục bộ hay toàn thân nào.
3.5.5.4. Phương pháp kiểm tra hiệu lực vắc xin (theo TCVN 8685-13:2014)
Đánh giá hiệu lực sản phẩm đồng thời thực hiện cả 3 phương pháp sau: - Xác định hàm lượng kháng thể bằng ELISA.
- Xác định hàm lượng kháng thể bằng IPMA. - Phương pháp công cường độc.
Gây miễn dịch
- Tiêm cho 5 lợn, mũi 1 tiêmlợn 21 ngày tuổi, mũi 2 tiêm lợn 42 ngày tuổi, khi lợn 70 ngày tuổi tiến hành công cường độc bằng chính chủng virus dùng sản xuất vắc xin KTY-PRRS-01 liều công là 100 TCID50.
Đánh giá hiệu giá kháng thể kháng virus PRRS bằng phản ứng ELISA
- Lấy máu, chắt huyết thanh tại các thời điểm lợn 70 ngày tuổi và 91 ngày tuổi, đánh giá hàm lượng kháng thể bằng phản ứng ELISA.
- Kết quả: Đánh giá theo bộ kit được sử dụng (S/P ≥ 0,4 dương tính, S/P < 0,4 âm tính).
Đánh giá hiệu giá kháng thể kháng virus PRRS bằng phản ứng miễn dịch có gắn Enzyme trên tế bào 1 lớp (IPMA - Immunoperoxidase monolayer assay)
- Lấy máu, chắt huyết thanh tại các thời điểm lợn 70 ngày tuổi và 91 ngày tuổi, đánh giá hàm lượng kháng thể bằng phản ứng IPMA.
- Kết quả: Hiệu giá kháng thể ≥ 1/640 đạt bảo hộ.
Đánh giá kết quả công cường độc
- Lô miễn dịch: 100% lợn sống khỏe mạnh, có thể có biểu hiện sốt nhẹ, kém ăn, chảy nước mũi trong khoảng 3-5 ngày sau công cường độc, sau đó trở lại bình thường.
- Lô đối chứng: lợn chết vì hội chứng PRRS hoặc có triệu chứng, bệnh tích điển hình của hội chứng PRRS.
Vắc xin được coi là đạt nếu đáp ứng được 03 chỉ tiêu nêu trên.
3.5.6. Phƣơng pháp IPMA (Immunoperoxidase monolayer assay): Phƣơng pháp miễn dịch có gắn enzyme trên thảm tế bào một lớp
Lấy mẫu: Lấy mẫu máu từ tĩnh mạch cổ của lợn. Tất cả mẫu bệnh phẩm sau khi lấy phải được bao gói cẩn thận, bảo quản ở 4 0C đến 8 0C và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm sớm nhất.
- Xử lý mẫu: mẫu máu khi lấy, để ở nhiệt độ phòng 2-3 giờ. Sau đó, cho mẫu vào tủ 4°C để ra huyết thanh. Chắt huyết thanh và chuyển mẫu sang ống eppendorf 1.5ml (ghi ngày tháng năm lấy mẫu, nơi lấy mẫu, số thứ tự của phòng thí nghiệm).
- Mẫu huyết thanh được xử lý nhiệt 560C trong 30 phút Bước 1: Nhân tế bào Marc-145 trên đĩa 96 giếng.
Pha tế bào mật độ 3x105 tế bào/ml, 10ml/đĩa trong môi trường DMEM 5% FBS. Cho vào mỗi giếng 100 µl /giếng. Theo dõi sự phát triển của tế bào hàng ngày.
- Nuôi trong tủ ấm 370C 5% CO2 sau 1 ngày bám đáy 100% tiến hành gây nhiễm vi rút.
Bước 2: Gây nhiễm Virus PRRS trên đĩa 96 giếng
Chuẩn bị Virus 100-200 TCID50/0,1ml. Pha loãng Virus đạt 100-200 TCID50 trong 100 µl DMEM.
Gây nhiễm virus: cho 100ul huyễn dịch Virus vào mỗi giếng. Riêng đối chứng tế bào cho 100 µl DMEM/giếng.
Theo dõi tế bào: Nuôi trong tủ ấm 370C, 5% CO2 trong 2 ngày. Theo dõi kiểm tra CPE tế bào hàng ngày.
Cố định tế bào gây nhiễm: Loại bỏ môi trường nuôi cấy tế bào. Đập nhẹ đĩa trên giấy thấm. Cho 100l dung dịch cố định 10% formaldehyde và 1% NP40. Để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau 30 phút loại bỏ dung dịch cố đinh. Cho 200l PBST vào mỗi giếng. Giữ dung dịch trên cho đến khi tiến hành phản ứng.
Cho huyết thanh: Pha loãng huyết thanh trên đĩa 96 giếng: Mỗi đĩa thực hiện 10 mẫu huyết thanh, 1 mẫu đối chứng âm, 1 đối chứng dương chuẩn theo bảng sau:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 [HT] A 1/40 B 1/80 C 1/160 D 1/320 E 1/640 F 1/1280 G 1/2560 H 1/5120 Mẫu M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 ĐC + ĐC - -
- Cho vào hàng A1-12 195 l, hàng B, C, D, F, G, H 150l dung dịch pha loãng mẫu. Cho vào hàng A1-12 5l huyết thanh theo thứ tự như trên. Trộn đều chuyển từ hàng A 100l sang hàng B trộn đều 15-20 lần sau đó lần lượt chuyển 100l từ hàng B sang hàng C. Thực hiện lần lượt đến hết hàng H
- Lọai bỏ dung dịch PBST đập nhẹ trên giấy thấm tránh để quá khô.
- Cho vào mỗi giếng 200 l dung dịch PBST. Loại bỏ dung dịch. Lặp lại 3 lần bước này. Bước cuối cùng đập nhẹ trên giấy thấm khô.
- Chuyển 50 l huyết thanh đã pha loãng sang đĩa tế bào tương ứng theo bảng trên (Chuyển huyết thanh từ độ pha loãng thấp đến cao).
- Để tủ ấm 370
C trong 30 phút
Rabbit anti pig Ig Fab2 (HRP) (Conjugate): Pha conjugate 1/400 hoặc 1/800 trong PBST, Loại bỏ huyết thanh, đập nhẹ trên giấy thấm.
- Cho vào mỗi giếng 200l dung dịch PBST. Loại bỏ dung dịch. Lặp lại 3 lần bước này. Bước cuối cùng đập nhẹ trên giấy thấm khô. Cho vào mỗi giếng 50l conjugate. Để tủ ấm 370C trong 30 phút
Cơ chất: loại bỏ conjugate, đập nhẹ, cho vào mỗi giếng 200l dung dịch PBST. Loại bỏ dung dịch. Lặp lại 3 lần bước này. Bước cuối cùng đập nhẹ trên giấy thấm khô. Cho vào mỗi giếng 50l dung dịch cơ chất và để tủ ấm 370C trong 30 phút (Tránh ánh sáng)
Quan sát và đọc kết quả:
- Mẫu dương tính: đám tế bào co cụm và bắt mầu đỏ đậm trong nguyên sinh chất. - Mẫu âm tính: Đám tế bào bắt đồng đều màu hơi hồng.
Mẫu dương tính Mẫu âm tính
3.5.7. Phƣơng pháp Elisa phát hiện kháng thể hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (theo TCVN 8400-21:2014)
Pha loãng mẫu: Mẫu cần kiểm tra gồm (huyết thanh, huyết tương) được pha
loãng thành 1/40 với dung dịch pha loãng mẫu (Dilution Buffer) (Lấy 10l huyết thanh pha với 390 l dung dịch pha loãng mẫu hoặc pha loãng 1/40 thành 2 lần: Lần 1: 10X; lần 2: 4X như sau:
+ Lần 1 (10X): Lấy 10l mẫu kiểm tra pha với 90ldung dịch pha loãng mẫu (Dung dịch A);
+ Lần 2 (4X): Lấy 30l dung dịch đã pha loãng ở lần 1 (Dung dịch A) pha với 90ldung dịch pha loãng mẫu (Dung dịch B);
Tiến hành phản ứng
Bước 1: Ủ mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng với kháng nguyên gắn đĩa
- Nhỏ 100 l mẫu đối chứng âm không pha loãng vào hai giếng đối chứng âm. - Nhỏ 100 l mẫu đối chứng dương không pha loãng vào hai giếng đối chứng dương;
- Nhỏ 100 l huyết thanh (dung dịch B) đã pha loãng vào các giếng thích hợp. - Vỗ nhẹ đĩa, đậy nắp và ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 phút;
- Nhỏ 200 l dung dịch rửa đã pha loãng vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại từ 3 đến 5 lần.
Bước 2: Nhỏ kháng kháng thể cộng hợp (conjugate)
- Nhỏ 100 l dung dịch kháng kháng thể cộng hợp (conjugate) vào các giếng;
- Vỗ nhẹ đĩa, đậy nắp và ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 phút; - Đổ bỏ dung dịch trong đĩa;
- Nhỏ 200l dung dịch rửa vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại từ 3 lần đến 5 lần.
Bước 3: Nhỏ cơ chất nhỏ 100 l dung dịch cơ chất TMB vào các giếng; - Vỗ nhẹ đĩa, đậy nắp và ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong trong 15 phút.
Bước 4: Dừng phản ứng nhỏ 100 l dung dịch dừng phản ứng (Stop Solution) vào các giếng; Đo giá trị OD bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 630 nm.
Đọc kết quả: Phản ứng được công nhận khi: + OD của đối chứng âm ≤ 0,15
+ OD của đối chứng dương - OD của đối chứng âm ≥ 0,15
S/P= (OD của mẫu -OD của đối chứng âm)/(OD của đối chứng dương - OD của đối chứng âm)
- Đánh giá kết quả: Mẫu dương tính: S/P ≥0,4; Mẫu âm tính: S/P < 0,4.
3.5.8. Phƣơng pháp phân lập virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (theo TCVN 8400-21:2014)
- Khi tế bào đã phát triển đầy bề mặt chai nuôi cấy trên 90% tạo thành tế bào một lớp thì tiến hành gây nhiễm tế bào.
- Bước 1: Chuẩn bị huyễn dịch virus 10%: đông tan huyễn dịch virus 10% - Bước 2: Rửa tế bào: lấy chai tế bào ra,lắc nhẹ chai. Sau đó, dùng pipette hút
bỏ môi trường trong chai tế bào. Rửa tế bào 2 lần bằng 5ml PBS, sau đó lắc nhẹ chai, hút bỏ PBS.
- Bước 3: Gây nhiễm tế bào: Chai đối chứng: Cho 1ml DMEM vào chai. Chai gây nhiễm: Chuyển 1ml huyễn dịch virus vào chai tế bào đã rửa sạch. Lắc nhẹ để huyễn dịch virus láng đều mặt tế bào.
- Nuôi 370C 5%CO2 trong 30 phút đến 1 giờ.
- Bước 4: Bổ sung môi trường: sau khi ủ 30 phút đến 1 giờ, bổ sung vào chai tế bào gây nhiễm 6ml môi trường DMEM 2% FBS.
- Bước 5: Theo dõi CPE hàng ngày: nuôi 370C 5% CO2 theo dõi CPE trong 3-5 ngày. Khi trên 90 % tế bào có CPE tiến hành thu virus bảo quản ở -400C, mẫu không có bệnh tích sau 5 ngày thu chai tế bào vào âm -400
C. - Bước 6: Thu virus: chai tế bào bảo quản tủ -400
C, đông tan thu virus, thu huyễn dịch tế bào vào ống li tâm 15. Li tâm 4000 vòng trong 10 phút ở 40C.
- Thu dịch nổi vào ống eppendorf 1.5 1ml/ống. Bảo quản -800C sử dụng cho các lần cấy chuyển tiếp sau. Với mẫu chưa có bệnh tích tế bào có thể tiến hành cấy chuyển lần 2-3. Giám định virus phân lập: sử dụng phương pháp RT-PCR phát hiện ARN virus.
3.6. XỬ LÝ SỐ LIỆU
Xử lý số liệu bằng phương pháp thống kê sinh học và xử lý trên phần mềm Excel.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. TỐI ƢU QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT KHÁNG NGUYÊN VIRUS PRRS TRÊN HỆ THỐNG CHAI ROLLER
Điều đầu tiên để sản xuất kháng nguyên virus PRRS đầu tiên cần sản xuất một lượng lớn tế bào làm môi trường cho virus PRRS nhân lên, Theo nghiên cứu của Kim và cộng sự virus PRRS thích nghi và nhân lên tốt trên tế bào Marc – 145 (Kim et al., 1993), vì vậy chúng tôi nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sản xuất Marc-145. Với ưu điểm làm tăng nhanh lượng tế bào nuôi, quá trình nuôi và thiết bị ban đầu đơn giản, dễ kiểm soát nhưng có thể tạo ra lượng lớn tế bào phục vụ sản xuất, chúng tôi lựa chọn nuôi cấy tế bào trên hệ thống chai lăn roller 2X.
4.1.1. Tối ƣu hóa quy trình nuôi tế bào Marc – 145 trên chai roller
Để thực hiện nuôi cấy tế bào Marc-145 trên chai roller 2X phục vụ sản xuất vắc xin chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy tế bào trong điều kiện không có CO2 (môi trường có bổ sung chất giúp ổn định pH)và trong điều kiện có 5% CO2 với lượng tế bào ban đầu đưa vào là 1,25x105 Tế bào/ml (OIE, 2015), nuôi trên chai roller 2X với lượng ra chai ban đầu 200 ml/chai sử dụng môi trường DMEM 5% FBS, tế bào được nuôi ở 370
C (trong phòng ấm), kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả kiểm tra khả năng phát triển tế bào Marc – 145 trong điều kiện có 5% CO2 và không có CO2
Thời gian theo dõi
Tỷ lệ tế bào bám đáy* Số tế bào chết sau 24h (tế bào/ml)
không có CO2 5% CO2 không có CO2 5% CO2
24h 30% 40% 8x103 tế bào/ml 3x103 tế bào/ml
48h 60% 70% - -
72h 90% 100% - -
96h 100% 100% - -
(*)Tỷ lệ tế bào bám đáy là khoảng ước lượng tế bào bám chai nuôi bằng mắt thường khi soi trên kính hiển vi
Từ bảng 4.1 cho thấy tế bào được nuôi trong điều kiện có 5% CO2 có thời gian tế bào phát triển bám đáy 100% nhanh hơn so với nuôi trong điều kiện không có CO2, số lượng tế bào chết sau 24h cũng thấp hơn 2 lần, tuy nhiên sau
72h nuôi cấy cả điều kiện nuôi cấy có CO2 và nuôi cấy không có CO2 tế bào bám đáy 90 – 100 %, đủ điều kiện để cấy chuyển hoặc gây nhiễm virus. Tuy nhiên trong sản xuất vắc xin công nghiệp nuôi cấy tế bào có CO2 sẽ phải đầu tư một phòng ấm lớn và hệ thống kiểm soát hàm lượng CO2 nghiêm ngặt, để làm được điều này chi phí đầu tư ban đầu rất lớn, theo dõi trong quá trình sản xuất gặp khó khăn. vì vậy để tạo điều kiện thuận lợi hơn trong sản xuất thực tế, chúng tôi lựa chọn nhân tế bào sản xuất trong điều kiện không có CO2.
Thí nghiệm xác định mật độ tế bào ra chai phù hợp nhất