Vi khuẩn KCO3 và GL01 đều phát triển mạnh trong khoảng nhiệt độ 27- 40oC , khó phát triển ở nhiệt độ thấp.
4.3 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM MỐC XANH CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT ĐÃ TUYỂN CHỌN TRÊN TRỰC TIẾP CÂY CÁC CHỦNG VI SINH VẬT ĐÃ TUYỂN CHỌN TRÊN TRỰC TIẾP CÂY LINH CHI ĐÃ BỊ NHIỄM BỆNH
Sau khi lây nhiễm nấm mốc xanh lên nấm Linh chi để cây bị nhiễm bệnh nặng , chúng tơi tiến hành bố trí thí nghiệm thử khả năng đối kháng của xạ khuẩn 116 trên trực tiếp những cây Linh chi đó.
Thí nghiệm: Linh chi được chia thành 2 nhóm, mỗi nhóm 2cây (tất cả Linh chi đều bị nhiễm nấm)
Nhóm 1: hàng ngày đều tưới 30ml/1cây dịch xạ khuẩn 116 nuôi lỏng lắc
13 20 27
31 37 40
sau 5 ngày (giá trị OD=0,788).
Nhóm 2: hàng ngày chỉ tưới nước Để 2 nhóm Linh chi cách li nhau.
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Quan sát và ghi lại kết quả trong vòng 20 ngày.
Hình 4.21. Thử khả năng đối kháng của xạ khuẩn 116 trên trực tiếp cây Linh chi bị nhiễm nấm mốc xanh
Kết quả đợt lây nhiễm vào giữa tháng 8 thời tiết nắng nóng, nhiệt độ trên 30oC nấm Linh chi phát triển mạnh lấn át các vết bệnh lây nhiễm khiến việc tiến hành đánh giá gặp khó khăn. Tiếp tục lây nhiễm nấm thì đến đầu tháng 9 nắng nóng giảm, mưa nhiều, thời tiết mát mẻ hơn, nhiệt độ dao động từ 25-30oC, Linh chi phát triển chậm lại cịn nấm mốc xanh thì mọc nhanh và lan rộng ra tạo thành các vết bệnh lớn quanh quả thể nấm Linh chi. Tiến hành thí nghiệm thử khả năng đối kháng của xạ khuẩn 116. Thu được kết quả trong 7 ngày đầu , vết bệnh nấm có dấu hiệu ngừng lan rộng ra , quan sát tiếp đến ngày 20 thì thấy cây đối chứng nấm bị lan rộng hơn còn đối với cây tưới xạ khuẩn116 thì vết bệnh khơng thể phát triển thêm. Kết luận, xạ khuẩn 116 có khả năng ức chế được vết bệnh nấm mốc xanh lan rộng trên Linh chi. Tuy nhiên vì lí do cây nấm Linh chi đã bị nhiễm bệnh quá nặng nên tưới dịch xạ khuẩn chỉ có thể ngăn vết bệnh phát triển khơng thể hết được hồn tồn.
Do điều kiện thời tiết giao mùa tại miền Bắc, nhiệt độ giảm, mát mẻ , mưa nhiều, không thuận lợi cho trồng Linh chi vụ mới, Linh chi vụ trước đã quá già , vì vậy việc sử dụng cây Linh chi non để lây nhiễm nấm mốc xanh và tiến hành đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn KCO3, GL01 trên trực tiếp cây Linh chi bị nhiễm nấm LC1 gặp khó khăn. Hơn nữa thời gian thực hành
luận văn cũng có hạn, vì vậy chúng tơi khơng thể tiến hành đánh giá khả năng đối kháng với nấm mốc xanh của 2 vi khuẩn GL01 và KCO3 trên trực tiếp cây Linh chi bị bệnh.
4.4. THẢO LUẬN
Nấm Linh chi, tên khoa học là Ganoderma lucidum, được biết đến rộng rãi là một dược liệu quý mà con người từ xa xưa đã biết dùng làm thuốc. Linh chi được xếp vào loại siêu thượng phẩm hơn cả nhân sâm, nó có tác dụng bảo can (bảo vệ gan), giải độc, cường tâm, kiện não (bổ óc), tiêu đờm, lợi niệu, ích vị (bổ dạ dày); gần đây các nhà khoa học Trung Quốc và Nhật phát hiện nấm linh chi cịn có tác dụng phịng và chống ung thư, chống lão hóa làm tăng tuổi thọ.
Ở các nước Đông Nam Á, nhất là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan...và cả Việt Nam việc nghiên cứu, phát triển và sử dụng Linh chi đang được cơng nghiệp hóa với quy mơ rộng lớn, cả về phân loại học, thu hái tự nhiên, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm, đồng thời nghiên cứu hóa dược các hoạt chất, tác dụng dược lý...Tuy nhiên, hiện nay có rất nhiều bệnh làm giảm sản lượng và chất lượng nấm, nghiêm trọng hơn là gây thất thu cho người trồng, đáng chú ý là bệnh nấm mốc xanh.
Do đó chúng ta cần phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm mốc gây bệnh trên nấm Linh chi đồng thời tìm kiếm và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm mốc xanh làm cơ sở để đưa ra giải pháp phòng chống bệnh.
4.4.1. Phân lập và nghiên cứu nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi Chúng tôi tiến hành phân lập chủng nấm mốc xanh từ các mẫu Linh chi bị Chúng tôi tiến hành phân lập chủng nấm mốc xanh từ các mẫu Linh chi bị nhiễm bệnh đã thu thập được. Sau khi phân lập thành cơng nấm mốc xanh kí hiệu LC1, tiến hành lây nhiễm nhân tạo trên nấm linh chi để khẳng định tính gây bệnh của nó. Dựa vào kết quả lây nhiễm nhân tạo, phân tích đặc điểm hình thái, và màu sắc khuẩn lạc. Chúng tôi xác định được chủng nấm mốc xanh thuộc chi nấm
Penicillium, phù hợp với nghiên cứu của Knee bone và Merek (1959.Tiếp sau đó,
tiến hành tách chiết DNA phục vụ cho phản ứng PCR để định danh cho kết quả tốt nhất. Gửi giải trình tự tại cơng ty 1st BASE (Singapore), sau khi nhận được trình tự, tiến hành so sánh trình tự thu được với các trình tự khác trên ngân hàng gen nhờ công cụ blast, dựng cây phân loại lập từ kết quả đó có thể thấy chủng nấm mốc LC1 nằm cùng nhánh với chủng Penicillium citrinum với giá trị bootstrap là 71. Bên cạnh đó kết quả căn trình tự nucleotide cho thấy mức độ tương đồng của
ITS rRNA của hai chủng là 92%. Xét về mặt giá trị tin cậy và mức độ tương đồng thì hai chủng này giống nhau. Ngồi ra các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa đã nghiên cứu, nhận thấy chủng nấm mốc LC1 có nhiều đặc điểm giống với chủng
Penicillium citrinum trên ngân hàng gen. Kết quả định danh cho phép chúng tôi
đưa ra kết luận chủng LC1 có quan hệ họ hàng gần gũi với loài Penicillium citrinum và chúng tôi đặt tên cho chủng này là Penicillium citrinum LC1.
Tiếp tục tiến hành ) đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của nấm LC1, khi nhỏ thuốc thử Lugol vào đĩa thử hoạt tính đã quan sát thấy vịng sáng xuất hiện. Điều này chứng tỏ chủng nấm mốc LC1 có khả năng sinh enzyme ngoại bào phân giải chitin và cellulose. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Đức Lượng et al. (2004), về khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của các chủng nấm mốc. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của nấm mốc xanh, chúng tôi đánh giá được những yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng của nấm LC1 và kết luận được nấm LC1 phát triển mạnh trên môi trường bổ sung đường đa (lactose, mantose, saccarose), mạnh nhất trên môi trường D-glucose. Dải pH và nhiệt độ của nấm LC1 khá rộng, sinh trưởng mạnh nhất trong khoảng pH 5.5-6.5, nhiệt độ tối ưu là 25-30oC. Phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Lân Dũng ( 1967).
Chính vì thế, vào thời điểm trong năm khi nhiệt độ hạ xuống mát mẻ, độ ẩm cao rất thuận lợi cho nấm mốc xanh phát triển và lan rộng. Người nuôi trồng Linh chi không chỉ giải quyết các vấn đề về môi trường và giá thể ni nấm mà cần chủ động có biện pháp phòng và chống trước thời điểm bệnh nấm mốc xanh phát triển mạnh.
4.4.2. Tuyển chọn vi sinh vật đối kháng với nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi nấm Linh chi
Đã có rất nhiều các biện pháp đã được áp dụng để ngăn ngừa dịch bệnh như sử dụng các loại hóa chất, các loại kháng sinh…Tuy nhiên, các biện pháp này không những không đem lại hiệu quả lâu dài mà còn gây ra nhưng hậu quả nghiêm trọng như ô nhiễm môi trường, chất lượng nông sản, sức khỏe mọi người. Cần có giải pháp vừa hiệu quả trong phòng chống bệnh hại vừa than thiện với môi trường và con người. Người nuôi trồng dần hướng đến các chế phẩm sinh học vì nó đáp ứng đầy đủ những mong muốn va tiêu chí tiêu dung của người trồng trọt. Chúng tôi tuyển chọn các mẫu xạ khuẩn và vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm mốc xanh gây bệnh trên Linh chi bằng phương pháp khuếch tán
đĩa. Kết quả thu được chủng xạ khuẩn là 116 và 2 chủng vi khuẩn GL01, KCO3 có khả năng kháng lại nấm mốc xanh. Chúng tơi tiến hành nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh lý sinh hóa của chủng xạ khuẩn 116: có hệ sợi khí sinh phân nhánh, dạng thẳng, khơng có vách ngăn, chuỗi bào tử ngắn, bào tử hình bầu dục chúng tơi dự đốn chủng xạ khuẩn 116 thuộc chi Streptomyces. Chủng 116
sinh trưởng tốt trong khoảng nhiệt độ 30-40oC , pH tối ưu là 8-10. Vi khuẩn GL01, KCO3 phát riển rất tốt ở khoảng nhiệt độ cao 25-40oC , trong khoảng PH tối ưu là 5,5-6,5. Sau đó bố trí thí nghiệm để đánh giá khả năng đối kháng của xạ khuẩn 116 với nấm mốc xanh trên trực tiếp cây Linh chi bị nhiễm bệnh. Chia thành 2 nhóm Linh chi (tất cả đều bị nhiễm nấm mốc xanh), sau đó tiến hành thí nghiệm 1 nhóm cây được tưới dịch xạ khuẩn, cịn 1 nhóm cây tưới nước và để cách li 2 nhóm này. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả cho thấy tuy xạ khuẩn đối khánh mạnh với nấm mốc xanh trong điều kiện in vitro nhưng khi thí nghiệm trên trực tiếp cây Linh chi bị nhiễm bệnh thì xạ khuẩn 116 chỉ giảm thiểu sự lây lan vết bệnh của nấm mốc trên cây nấm Linh chi nhưng không thể diệt được hoàn toàn được nấm mốc xanh để cây trở về sạch bệnh .
Tuy nhiên do quá vụ Linh chi, chúng tơi khơng có mẫu nấm Linh chi non để tiến hành bố trí thí nghiệm lây nhiễm nấm LC1 sau đó đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn GL01, KCO3 trên trực tiếp cây nấm Linh chi bị nhiễm bệnh cùng với đó điều kiện thời gian làm luận văn khơng cho phép bố trí những thí nghiệm cần nhiều thời gian đánh giá như vậy.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN 5.1. KẾT LUẬN
1. Phân lập được chủng nấm mốc xanh từ những mẫu nấm Linh chi
Ganoderma lucidum bị nhiễm bệnh, kí hiệu LC1.
2. Qua nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh học của chủng LC1 xác định được nấm LC1 thuộc chi nấm Penicillium.
3. Qua phân tích các đặc điểm sinh học kết hợp với kết quả định danh cho thấy chủng LC1 có quan hệ họ hàng gần gũi với lồi Penicillium citrinum và chúng tơi đặt tên cho chủng này là Penicillium citrinum LC1.
4. Tuyển chọn được chủng xạ khuẩn 116 và 2 chủng vi khuẩn GL01, KCO3 đối kháng với nấm LC1 trong điều kiện in vitro.
5. Qua nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh học chúng tơi dự đốn chủng xạ khuẩn 116 thuộc chi Streptomyces.
6. Qua thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng của chủng xạ khuẩn 116 với nấm mốc xanh trên trực tiếp cây nấm Linh chi bị nhiễm bệnh cho thấy chủng 116 có thể giảm thiểu sự lây lan của vết bệnh nhưng khơng thể diệt hồn tồn được bệnh nấm mốc xanh trên cây Linh chi bị bệnh.
5.2. KIẾN NGHỊ
1. Nghiên cứu nên mở rộng ngồi phạm vi phịng thí nghiệm để đánh giá chính xác hơn những yếu tố ngoại cảnh tác động đến sinh trưởng của nấm Linh chi cũng như bệnh nấm mốc xanh.
2. Tiến hành bố trí các thí nghiệm đánh giá cả trong điều kiện in vitro và in
vivo với các phương pháp và nồng độ khác nhau để thu được kết quả tốt nhất.
3. Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài còn hạn chế về thời gian nghiên cứu và số lương mẫu nấm Linh chi để bố trí nhiều thí nghiệm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt:
1. Bản tin Khoa học cơng nghệ Số: 01/2017 PHỤC VỤ NƠNG NGHIỆP, NƠNG
THƠN- Sở khoa học và cơng nghệ tỉnh Quảng Trị.
2. Đặng Thị Hoàng Oanh, 2008. Giáo trình vi sinh đại cương. Khoa thủy sản. Đại
học Cần Thơ.
3. Hồ Thị Kim Thạch-Tình hình nhiễm bệnh của một số cơ sở bào ngư và linh chi-
2010- Tạp chí khoa học và ứng dụng.(13).
4. Lê Duy Thắng - Kỹ thuật trồng nấm – Tập 1 - NXB Nông Nghiệp, 2005
5. Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, 2004. Công nghệ Enzyme.
Nhà xuất bản Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
6. Nguyễn Lân Dũng, 2000. Vi Sinh Vật học. Nhà xuất bản giáo dục. Hà Nội .
7. Phạm Văn Kim, 2001. Giáo trình vi sinh đại cương. Khoa Nơng nghiệp, Đại học
Cần thơ.
Tiếng Anh:
8. Asai, K. (1980). Miracle Cure Organic Germanium. Japan: Japan Publications,
pp. 16-76.
9. Boone, David R.; Castenholz, Richard W. (May 18, 2001) [1984(Williams & Wilkins)]. George M. Garrity, ed. The Archaea and the Deeply Branching and Phototrophic Bacteria. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 1 (2nd ed.). New York: Springer. p. 721. ISBN 978-0-387-98771-2. British Library no. GBA561951. 10. Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., & Wolfe, R. S. (1979).
Methanogens: reevaluation of a unique biological group. Microbiological reviews, 43(2), 260.
11. Boh, B. (2013). Ganoderma lucidum: a potential for biotechnological production of anti-cancer and immunomodulatory drugs. Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery, 8(3).pp. 255-287.
12. Carmen Sánchez (2016). Reactive oxygen species and antioxidant properties from mushrooms. Synthetic and Systems Biotechnology . Volume 2, Issue1,pp.13–22.
13. Chiu, S. W., Law, S. C., Ching, M. L., Cheung, K. W., & Chen, M. J. (2000). Themes for mushroom exploitation in the 21st century: sustainability, waste management, and conservation. The Journal of general and applied microbiology, 46(6).pp. 269-282.
14. Chen, A. W., & Miles, P. G. (1996). Biomedical research and the application of mushroom nutriceuticals from Ganoderma lucidum. Mushroom Biology and Mushroom Products.pp.161-175.
15. Don J. Brenner; Noel R. Krieg; James T. Staley (July 26, 2005) [1984(Williams & Wilkins)]. George M. Garrity, ed. Introductory Essays. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 2A (2nd ed.). New York: Springer. pp. 304. ISBN 978-0- 387-24143-2. British Library no. GBA561951.
16. Hikino, H., Konno, C., Mirin, Y., & Hayashi, T. (1985). Isolation and hypoglycemic activity of ganoderans A and B, glycans of Ganoderma lucidum fruit bodies. Planta medica, 51(04).pp. 339-340.
17. Gao, Y., S. Zhou, W. Jiang, M. Huang and X. Dai. (2003). Effects of ganopoly (a Ganoderma lucidum polysaccharide extract) on the immune functions in advanced-stage cancer patients. Immunological Investigations, 32(3).pp.201-215. 18. Gary E. K. ( 2002). Microbiology learning object 1: Introduction to microbiology,
the prokaryotic cell (bacteria) and the eukaryotic cell.
19. Gary E. K. (2002). Microbiology learning object 2: Fungi, protozoa, viruses, and the innate immune system.
20. Kneebone, L. R., & Merek, E. L. (1961). Brief outline of and controls for mushroom pathogens,indicator molds, and weed molds or competitors.
21. Kenneth Todar, (2003). Major groups of prokaryotes. Department of
Bacteriology. University of Wisconsin-Madison.
22. Kenneth Todar, (2003). Structure and function of procaryotic cells. Department of Bacteriology. University of Wisconsin-Madison.
23. Mitra, A., Santra, S. C., & Mukherjee, J. (2008). Distribution of actinomycetes, their antagonistic behaviour and the physico-chemical characteristics of the
world’s largest tidal mangrove forest. Applied microbiology and
24. Madigan, M.T., Martinko, J.M. and Parker, J. (2002). Biology of Microorganisms. Tenth edition, Prenhall.
25. Mengjiao Li, Tianxi Chen, Tan Gao, Zhigang Miao, Ailiang Jiang, Liang Shi, Ang Ren, Mingwen Zhao, (2015). “UDP-glucose pyrophosphorylase influences polysaccharide synthesis, cell wall components, and hyphal branching in Ganoderma lucidum via regulation of the balance between glucose-1-phosphate and UDP-glucose”, Fungal Genetics and Biology, 82.pp. 251–263.
26. Montani M, Vaamonde G, Resnik SL, Buera P. (1988). Temperature influence on
Penicillium citrinum thom growth and citrinin accumulation kinetics. Int J Food Microbiol..pp.115-22.
27. Pooja Kapoor and B.M. Sharma, (2014). “Studies on different growth parameters
of Ganoderma lucidum”. International Journal of Science and Technology, Vol. 3, No 4.pp.1515 – 1524.
28. S. Srivastava (2003). Bergey's Manuals, Understanding bacteria , Springer, pp. 40 29. Visagie C.M., Houbraken J., Frisvad J.C., Hong S.-B., Klaassen C.H.W., Perrone G., Selfert K.A., Varga J., Yaguchi T., and Samson R.A. (2014). “Indentification and nomenclature of the genus Penicillium”, Studies in Mycology, 78.pp. 343–371.
30. Wagner, R., Mitchell, D. A., Lanzi Sassaki, G., Lopes de Almeida Amazonas, M.
A., & Berovič, M. (2003). Current techniques for the cultivation of Ganoderma lucidum for the production of biomass, ganoderic acid and polysaccharides. Food technology and biotechnology, 41(4).pp. 371-382.
PHỤ LỤC