Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.7. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Cho 150 µl đệm chiết vào ống eppendorf đã chuẩn bị sẵn
Dùng tăm nhọn lấy mẫu nấm bệnh cho vào ống eppendorf bên trên ( Lượng lấy cỡ đầu một que diêm)
Dùng chày nhựa nghiền nát sinh khối sợi nấm trong ống eppendorf Bổ sung thêm 450µl đệm chiết vào ống eppendorf bên trên
Hỗn hợp được trộn đều, đem ủ ở 60°C trong 30 phút đến 1 giờ
Sau đó bổ sung thêm 200µl natri acetate 5M, trộn đều và ly tâm ở 12000v/phút, trong 30 phút, ở 4°C
Dịch nổi được chuyển sang một ống Eppendorf mới và bổ sung isopropanol lạnh để tủa DNA. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Sau đó đem ly tâm ở 12000v/phút, 15 phút, 4°C
Đổ bỏ phần dịch trong nhẹ nhàng, tủa được rửa trong 1000µl ethanol 70% Ly tâm ở 10000v/phút, 10 phút, 4°C, sau đó để khơ và bổ sung thêm 50µl TE
Sản phẩm được điện di trên gel agarose 1% được chuẩn bị bằng đêm TAE và chứa 0,5 mg/mL ethidium bromide.
Phản ứng PCR nhân trình tự
Khuếch đại vùng bảo thủ của ITS rRNA với cặp mồi có. Trình tự cặp mồi:
ITS1 : 5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ITS4 : 5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
Thành phần phản ứng: Nước : 6µl Master mix (2X) : 10µl ITS1 : 1µl ITS4 : 1µl AND : 2µl Tổng thể tích : 20µl
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:
- Biến tính: 95°C - 5 phút.
- Tiếp đến 30 chu kỳ: 94°C – 1 phút, 60°C – 30 giây, 72°C – 1phút. - Tổng hợp cuối cùng:. 72°C – 7 phút.
- Bảo quản ở 4°C.
Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0.8%. Đun tan 0.8% agarose (dung dịch TBE 10X 8ml, nước cất 2 lần 72ml,agarose 0.64g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong dung dịch TBE 1X. Nhỏ mẫu DNA vào giếng và chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cường độ dòng điện 90 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr 20 phút. Vớt ra và quan sát trong máy soi gel.
- Phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại
Mức độ tương đồng về trình tự gen mã hóa ITS rARN của chủng nghiên cứu được so sánh với các chủng đã công bố trên ngân hàng gen sử dụng công cụ tra cứu Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), công cụ ClustalX2 và phần mềm MEGA7.
Sử dụng đoạn trình tự gen của chủng nghiên cứu, sử dụng công cụ Blast để tìm và chọn ra các chủng chuẩn đã cơng bố có mức độ tương đồng cao với chủng nghiên cứu. Truy cập vào cơ sở dữ liệu DNA của ngân hàng gen để tải các trình tự đó về. Căn trình tự để nhận biết các đoạn trình tự giống nhau giữa trình tự DNA truy vấn và trình tự DNA của các loài đã biết trên ngân hàng gen.
Tiến hành xây dựng cây phân loại dựa trên trình tự gen đã được định dạng đúng với phần mềm. Sử dụng phần mềm MEGA7 để xây dựng cây xác định mối
quan hệ di truyền, lựa chọn phương pháp Maximum Parsimony với độ tin cậy được tính bằng thuật tốn Bootstrap với 1000 lần lặp lại. Dựa vào cây phân loại và giá trị bootstrap để xác định mối quan hệ di truyền của chủng nghiên cứu. 3.2.8. Vi sinh vật
3.2.8.1. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với vi nấm gây bệnh trên nấm Linh chi
► Phương pháp nuôi cấy
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause-1 và ISP2 Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường LB
Các chủng vi sinh vật được bảo quản trong dung dịch glycerol 30% ở điều kiện -21°C. Trước khi thử khả năng đối kháng tiến hành hoạt hóa trên mơi trường Gause-1, LB sau đó cấy chuyển 1-2 lần mới tiến hành thử.
► Thử khả năng đối kháng vi nấm gây bệnh trên nấm Linh chi bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Dhanasekaran et al., 2012):
- Bước 1: Nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trường ISP2 lỏng lắc 200
vòng/phút ở 30oC. Dịch xạ khuẩn được thu sau 7 ngày nuôi cấy.
- Bước 2: Nấm được hoạt hóa và làm thuần trên mơi trường PDA, dùng
que cấy lấy sợi nấm cho vào ống eppendorf chứa 500µl nước cất vơ trùng, voltex để bào tử nấm phát tán đều trong nước.
- Bước 3: Chang đều 50µl dung dịch nấm lên đĩa thạch PDA. Sau đó đục 4
giếng trên đĩa với đường kính 0.7cm.
- Bước 4: Bổ sung 100µl dịch xạ khuẩn, vi khuẩn không ly tâm vào giếng,
ủ ở 30oC.
- Bước 5: Quan sát kết quả sau 3-4 ngày. Hoạt tính đối kháng của xạ khuẩn
đối với nấm sợi gây bệnh trên nấm linh chi được đánh giá bằng cách đo vòng sáng trên (D - d) mm (với D - đường kính vịng kháng nấm và d - đường kính giếng thạch) trên đĩa thạch.
3.2.8.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn và vi khuẩn a. Đặc điểm hình thái
► Đặc điểm hình thái khuẩn lạc:
thạch Gause-1. Sau khi nuôi từ 4 – 5 ngày ở 30ºC lấy ra quan sát hình thái khuẩn lạc, mép khuẩn lạc. Các dạng khuẩn lạc có thể là dạng thô ráp, dạng phấn, khơng trong suốt, có nếp tỏa ra theo hình phóng xạ dạng bơng, dạng nhẵn, dạng nhăn nheo…
Cấy các chủng vi khuẩn trên mơi trường LB theo hình ziczac. Sau ni cấy 1-2 ngày ở 30oC lấy ra quan sát màu sắc, kích thước, độ nhầy....
► Cuống sinh bào tử, bào tử:
Chủng xạ khuẩn được cấy trên môi trường ISP2 theo hình ziczac, găm lamen xuống đường cấy nghiêng một góc 45°, vi khuẩn được cấy trên mơi trường LB. Nuôi trong tủ nuôi 30°C và quan sát chuỗi bào tử, cuống sinh bào tử, bề mặt bào tử sau từng ngày nuôi cấy dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần.
b. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa
► Khả năng sử dụng nguồn cacbon:
Xạ khuẩn được ni trên MT ISP-9 có bổ sung 1 % các nguồn đường như: D-Glucose, D-Fructose, D-Maltose, Saccarose, Xylose, Dextri, Lactose.
Cấy ria xạ khuẩn trên môi trường đã bổ sung các loại đường, nuôi ở tủ ni 30°C trong vịng 5 – 7 ngày. Quan sát và đánh giá sự sinh trưởng trên các mơi trường, từ đó đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon của xạ khuẩn.
► Khả năng sử dụng nguồn Nitrogen:
Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường Starch Nitrate, lượng NaNO3 được thay thế bằng các nguồn nitrogen khác nhau với %N theo khối lượng bằng 0.33%. Các nguồn ni tơ là (g/100ml): Pepton 0.2 g; (NH4)2SO4 0.155 g; NH4Cl 0.126 g; NH4NO3 0.094 g. Môi trường Starch Nitrate chứa 0.2 g/100 ml NaNO3 được xem là đối chứng dương.
► Khả năng chịu muối:
Môi trường thạch nghiêng Gause-1 được bổ sung NaCl với nồng độ từ 1 - 9%. Cấy chủng xạ khuẩn, nuôi ở 30°C, quan sát sự sinh trưởng sau 5 - 7 ngày.
Từ đó tìm ra nồng độ muối thích hợp cho sự phát triển của xạ khuẩn. ► Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của xạ khuẩn, vi khuẩn:
Chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên đĩa petri chứa môi trường Gause-1 ở pH 5-6- 7-8-9-10 ở nhiệt độ 30°C, quan sát sự sinh trưởng sau 5 - 7 ngày.
Vi khuẩn được nuôi cấy trên đĩa petri chứa môi trường LB ở pH 5-5,5-6- 6,5-7-7,5 ở nhiệt độ 30°C, quan sát sự sinh trưởng sau 2 ngày.
► Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của xạ khuẩn, vi khuẩn:
Chủng xạ khuẩn được nuôi trên MT ISP2 ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau: 4°, 20°, 30°, 37°, 40°, 50°. Quan sát sự sinh trưởng sau 5 - 7 ngày.
Vi khuẩn được nuôi cấy trên đĩa petri chứa môi trường LB ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau 13o, 20o, 27o, 31°, 37°, 40°. Quan sát sự sinh trưởng sau 2 ngày.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CHỦNG NẤM MỐC XANH GÂY BỆNH TRÊN NẤM LINH CHI GÂY BỆNH TRÊN NẤM LINH CHI
4.1.1. Kết quả phân lập
Tiến hành phân lập các chủng nấm từ 40 mẫu quả thể nấm Linh chi bị nhiễm bệnh nấm đã được nhận, sử dụng mơi trường PDA. Sau q trình cấy chuyển và làm thuần, kết quả phân lập được 6 chủng nấm.
Các chủng nấm sau khi phân lập được giữ trong ống nghiệm môi trường PDA thạch nghiêng để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Đồng thời, các chủng này còn được bảo quản lạnh ủ sâu nhằm giữ được giống trong thời gian dài. Kết quả được chỉ ra ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả phân lập nấm nấm mốc gây bệnh
STT Kí hiệu
chủng nấm
Đặc điểm chủng nấm Hình thái khuẩn lạc
1 LC1 Màu xanh lì, phát triển nhanh, dễ phát
tán bào tử, làm đổi màu môi trường sang màu vàng, khuẩn ty khí sinh, kích thước khuẩn lạc nhỏ 5-10mm
2 LC2 Sợi nấm trắng bông, phát triển rất
nhanh, khi già chuyển màu xanh, phát tán bào tử chậm, khuẩn ty khí sinh, kích thước khuẩn lạc lớn
3 LC3 Sợi nấm trắng bông mỏng chuyển vàng
khi già, dễ phát tán bào tử, khuẩn ty khí sinh, kích thước khuẩn lạc 20-30mm, có vịng trịn đồng tâm
STT Kí hiệu chủng nấm
Đặc điểm chủng nấm Hình thái khuẩn lạc
4 LC4 Sợi nấm màu trắng, chuyển đen khi già,
sợi bông, phát triển nhanh, dễ phát tán bào tử, khuẩn ty khí sinh, kích thước khuẩn lạc lớn, có vịng trịn đồng tâm
5 LC5 Sợi bông, mỏng, dạng sợi mọc tủa, phát
triển chậm, khuẩn ty khí sinh, kích thước khuẩn lạc lớn
6 LC6 Màu xanh rêu sợi bông, mỏng, dạng sợi
mọc tủa, phát triển chậm, khuẩn ty khí sinh, kích thước khuẩn lạc lớn
4.1.2. Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên nấm Linh chi
Tiến hành lây nhiễm nhân tạo trên nấm Linh chi nhằm đánh giá tính gây bệnh của 6 chủng nấm đã phân lập được. Nuôi lỏng 6 chủng nấm trong môi trường PDA lỏng, thời gian 3-4 ngày, sau đó dùng dao gây vết thương nhân tạo trên các quả thể nấm Linh chi, hút dịch nấm sợi nhỏ vào mỗi quả thể nấm linh chi trong 3 ngày. Ở mẫu đối chứng chỉ tiến hành tưới nước sạch. Ở lần lây nhiễm đầu tiên do độ ẩm thấp, nhiệt độ cao, kết quả nấm linh chi không bị nhiễm nấm. Lần lây nhiễm thứ hai và thứ ba, điều chỉnh các yếu tố nhiệt độ, độ ẩm, thu được nấm linh chi nhiễm các chủng nấm đã phân lập bên trên. Kết quả, sau 3 lần lây nhiễm nhân tạo, ở lần lây nhiễm thứ hai và thứ ba đều thu được kết quả: Chủng LC1 và LC3 sau 3 ngày bắt đầu có hiện tượng nấm mọc ở quả thể. Sau 5 ngày nấm bắt đầu phát triển mạnh. Sau 7 ngày nấm phát triển lan khắp quả thể, sau đó lan sang, gây bệnh ở các bịch xung quanh.. Tiếp tục chăm sóc các bịch nấm và
quan sát. Sau nhiều tháng nấm bệnh khơng có dấu hiệu bị chết. Từ kết quả lây nhiễm nhân tạo cho thấy 2 chủng LC1, LC3 được xác định là các chủng nấm gây bệnh trên nấm Linh chi.
Chú ý:
Ở điều kiện nhiệt độ cao, độ ẩm thấp, thống khí nấm Linh chi có khả năng tự làm làm vết thương bằng cách mọc trùm lên vết thương
LC1 LC3
ĐC
Hình 4.1. Kết quả lây nhiễm nhân tạo
Từ kết quả lây nhiễm cho thấy mẫu lây nhiễm nhân tạo nấm mốc LC1, vết bệnh từ trắng xanh lục, bào tử tạo thành mảng mịn,bột, mọc sát vào bề mặt nấm Linh chi, vết bệnh trải rộng nhanh. Phù hợp với những đặc điểm bệnh lí của bệnh nấm mốc xanh theo hướng đề tài nghiên cứu. Vì vậy chúng tơi chọn nấm LC1 để đi sâu vào định danh và nghiên cứu đặc điểm sinh học của nó.
4.1.3. Định danh chủng nấm LC1
a) Định danh sơ bộ
Dựa trên kết quả lây nhiễm nhân tạo, tiến hành quan sát nấm gây bệnh dưới kính hiển vi để nắm được đặc điểm hình thái chi tiết. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả quan sát nấm LC1 gây bệnh bằng kính hiển vi
Hệ sợi Cành bào tử Bào tử
Hệ sợi phân nhánh, có vách ngăn ngang
Sinh sản vơ tính nhờ các cuống bào tử phân nhánh với các thể bình cấp 1, 2...và tận cùng bằng các đính bào tử trần, thể bình kiểu cổ rộng, các chuỗi bảo từ trần tụ lại thành dạng cột Bào tử trần, hình cầu, mép nhẵn, màu xanh lục, phát tán dễ dàng trong khơng khí
Sau khi tiến hành quan sát đặc điểm hình thái và đem so sánh với đặc điểm hình thái của một số chi nấm và dựa vào kết quả lây nhiễm nhân tạo, phân tích đặc điểm hình thái. Chúng tơi xác định được: Nấm mốc xanh LC1 đã phân lập được thuộc chi nấm Penicillium.
b) Định danh chủng nấm mốc LC1
Để định danh chủng nấm mốc trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp sinh học phân tử dựa trên độ tương đồng của đoạn gen ITS rARN của chủng này với các chủng nấm mốc đã công bố trên ngân hàng gen. DNA của chủng nấm mốc được tiến hành tách chiết . Sau đó sử dụng cặp mồi ITS1 và ITS4 để khuếch đại đoạn gen ITS rRNA của chủng LC1 đã được sử dụng,
kết quả điện di thu được 1 băng DNA duy nhất có kích thước khoảng 600 bp phù hợp với kích thước lý thuyết có thể đạt được khi nhân bằng đoạn mồi này (Hình 4.2).
Marker LC1
Hình 4.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự tại công ty 1st BASE (Singapore). Sau khi nhận được trình tự, tiến hành so sánh trình tự thu được với các trình tự khác trên ngân hàng gen nhờ công cụ blast, xây dựng cây phân loại cho chủng LC1 bằng phần mềm MEGA7. Kết quả được thể hiện ở hình 4.3.
Dựa vào cây phân loại này có thể thấy chủng nấm mốc LC1 nằm cùng nhánh với chủng Penicillium citrinum với giá trị bootstrap là 71. Bên cạnh đó kết quả căn trình tự nucleotide cho thấy mức độ tương đồng của ITS rRNA của hai chủng là 92%. Xét về mặt giá trị tin cậy và mức độ tương đồng thì hai chủng này giống nhau. Ngoài ra các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa đã nghiên cứu, nhận thấy chủng nấm mốc LC1 có nhiều đặc điểm giống với chủng Penicillium
Penicillium subarcticum NR 121276.1 Penicillium singorense NR 137877.1 Penicillium adametzioides NR 103660.1(2) Penicillium adametzioides NR 103660.1 Penicillium tropicum NR 111485.1 Penicillium gorlenkoanum NR 111484.1 Penicillium sumatrense NR 119812.1 Penicillium pasqualense NR 121513.1 Penicillium zhuangii NR 138343.1 Penicillium coffeae NR 121312.1 Penicillium atrofulvum NR 111665.1 Penicillium koreense NR 138347.1 Penicillium dierckxii NR 121329.1 Penicillium malacaense NR 121344.1 Penicillium hetheringtonii NR11482.1 Penicillium cairnsense NR 121508.1 Penicillium citrinum NR 121224.1 LC1 95 55 95 93 99 50 45 99 71 54 42 15 48 17 14 0.20
Hình 4.3. Kết quả xây dựng cây phân loại cho chủng LC1
Chính vì vậy, kết hợp các đặc điểm sinh học và phương pháp sinh học phân tử, chúng tôi đưa ra kết luận chủng LC1 có quan hệ họ hàng gần gũi với lồi Penicillium citrinum và chúng tôi đặt tên cho chủng này là Penicillium citrinum LC1.
4.1.4. Kết quả xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng LC1 Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra thành tế bào của nấm Linh chi Ganoderma Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra thành tế bào của nấm Linh chi Ganoderma lucidum được cấu tạo chủ yếu bởi chitin và β-1,3-glucan (Mengjiao Li et al.,
2015). Các chủng nấm muốn phá hủy thành tế bào của nấm linh chi thì các chủng này phải có khả năng phân giải chitinvà cellulose. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng sinh enzyme phân hủy chitin và cellulose của chủng nấm mốc LC1. Khi chủng nấm mốc có khả năng sinh enzyme ngoại bào sẽ phân giải chitin và cellulose thành các cấu trúc mạch
ngắn hơn. Các dạng này không phản ứng màu với thuốc thử Lugol, do đó sau khi nhỏ thuốc thử Lugol sẽ tạo thành vòng sáng. Độ lớn của vòng sáng phản ánh khả năng sinh tổng hợp loại enzyme này. Tiến hành nuôi lỏng chủng LC1 từ 2- 5 ngày thu dịch sử dụng phương pháp xác định khả năng sinh enzyme