Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.1. Vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Nguyên liệu và địa điểm nghiên cứu
- Mẫu nấm bệnh nhận từ Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam”.
- Các chủng vi sinh vật được lưu trữ tại phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ vi sinh – Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại phịng thí nghiệm thuộc Bộ môn Công nghệ vi sinh – Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Thời gian: Đề tài thực hiện từ 1/2017 – 9/2017. 3.1.2. Thiết bị và hóa chất
Các thiết bị và hóa chất phục vụ cho q trình thực hiện đề tài thuộc phịng thí nghiệm Bộ mơn Vi sinh, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam.
Thiết bị: đĩa petri, ống nghiệm, bình định mức, bình trụ, bình tam giác, ống fancol, que cấy, lamen, lam kính, đèn cồn, buồng cấy vi sinh vật, tủ sấy, nồi hấp vơ trùng, máy lắc, máy li tâm, kính hiển vi quang học, tủ lạnh, bể ổn nhiệt,...
Hóa chất: Agar, D-glucose, đệm photphat, dịch chiết khoai tây, Tinh bột tan, Glucose, Fructose, Saccarose, cao nấm men, cao malt, cao thịt, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, NaCl, KNO3, FeSO4…
Hóa chất tách chiết DNA tổng số: SDS 2,5 % Tris HCl 1M (pH = 8 ) EDTA 0,5 M NaCl 1M Cồn tuyệt đối Cồn 70° Isopropan TE CTAB Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)
Hóa chất PCR:
DNA nấm sợ gây bệnh, xạ khuẩn mới tách Mồi xuôi
Mồi ngược
Nước cất 2 lần hấp khử trùng Master Mix 2X
Cặp mồi 27F, 1492R
Hóa chất điện di kiểm tra sản phẩm: agarose nguyên chất
TBE buffer (Tris, acid boric, EDTA) Loading dye 5X
Chỉ thị phân tử (leader 100bp) Dung dịch Ethydium Bromide 3.1.2. Môi trường
Thành phần các loại mơi trường được sử dụng trong q trình thực hiện đề tài:
A. Nấm
Môi trường PDA
Nước chiết khoai tây : 200ml D-Glucose : 20g Agar : 20g
Nước cất : 1000ml -> hấp khử trùng Cách pha dịch chiết khoai tây
- Khoai tây gọt vỏ rửa sạch rồi mang đi cân. Đối với 200g khoai tây ta cất nhỏ rồi thêm vào tương đương 1lit nước cất . Đun khoai tây tầm 30 phút rồi lọc lấy dịch trong.
Môi trường SNA gồm: K2HPO4 : 1g KNO3 : 1g MgSO4 : 0,5g KCL : 0,5g Glucose : 0,2g
Saccarose : 0,2g Agar : 20g Bổ sung thể tích lên 1l
Mơi trường cao nấm men thạch (g/l) Cao nấm men : 5g
Glucose : 10g Agar : 20 g
Môi trường Czapek Saccarose : 30g NaNO3 : 3g K2PO4 : 1g MgSO4.7H2O : 0,5g KCl : 0,5g FeSO4 : 0,1g Bổ sung thể tích lên 1l B. Xạ khuẩn, vi khuẩn
+ Môi trường LB (g/l): Cao nấm men 5g; Pepton 10g; NaCl 10g; Agar 20g; nước 1 lít; pH=6-7.
+ Môi trường Gause I (g/l): Tinh bột tan 20 g; K2HPO4 0.5 g; MgSO4.7H2O 0,5 g; NaCl 0,5 g; KNO3 0.5 g; FeSO4 0.01 g; Agar 20 g; nước 1 lít; pH = 7 – 7,4.
+ Môi trường ISP1 (g/l): Tryptone 5 g; cao nấm men 3 g; Agar 20 g; nước cất 1 lít; pH = 7,0 - 7,2.
+ Môi trường ISP2 (g/l): Cao nấm men 4 g; dịch chiết Malt 10 g; glucoza 4 g; Agar 20 g; nước cất 1 lít; pH = 7,3.
+ Môi trường ISP3 (g/l): FeSO4.7H2O 0,01 g; MnCl2.4 H2O 0,1 g; ZnSO4.7H2O 0,1 g; nước cất vừa đủ 100 ml; pH = 7,0 - 7,2.
+ Môi trường ISP4 (g/l): Tinh bột 10 g; K2HPO4 1 g; MgSO4.7H2O 1 g; NaCl 1 g; (NH4)2SO4 2 g; CaCO3 2 g; dung dịch muối vi lượng 1,0 ml; Agar 20 g; nước cất 1 lít; pH = 7,0 - 7,4.
+ Dung dịch muối vi lượng của ISP: Bột yến mạch 20 g; Agar 20 g; dung dịch muối vi lượng 1,0 ml; nước cất 1 lít; pH = 7,0 - 7,4.
+ Môi trường PDA (g/l): nước chiết khoai tây; glucoza 20g; Agar 20g; nước cất 1 lít; pH = 7,0.
+ Mơi trường Czapek-dox (g/l): Saccharose: 30g; NaNO3: 3,5g; KH2PO4: 1,5g; KCl: 0.5g; MgSO4.7H2O: 0.5g; FeSO4.7H2O: 0.1g; Agar: 20g; Nước cất: 1 lít; pH = 5,0 – 5,5.
+ Môi trường ISP9 (g/l): (NH4)2SO4 2,64 g; KH2PO4 2,38 g; K2HPO4.3H2O 5,65 g; MgSO4.7H2O 1 g; dung dịch B 1,0 ml; nguồn cacbon 10 g; Agar 20 g; nước cất 1 lít; pH = 6,8 - 7,0.
Dung dịch muối B (%): CuSO4.5H2O 0,64 g; FeSO4.7H2O 0,11 g; MnCl2.4H2O 0,79 g; ZnSO4.7H2O 0,15g; nước cất 100 ml.
Các nguồn cacbon: D-Glucose, D-Fructose, D-Maltose, Saccarose, Lactose, Dextrin, Xylose.
3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1. Phương pháp thu nhận và phân lập mẫu
Dùng dao, kéo cắt lấy quả thể nấm Linh chi bị bệnh cho vào túi nilong, buộc kín.
Ghi ngày, tháng, nơi lấy mẫu, đánh số, bảo quản lạnh.
Dùng dao, tăm đã khử trùng cạo bề mặt nấm mốc trên mẫu nấm Linh chi nhiễm bệnh đã được lấy ở trên. Cấy lên bề mặt đĩa thạch đã có sẵn mẫu mơi trường. Mẫu được bọc lại và đem đi ủ ở 30°C. Sau 2-3 ngày khuẩn lạc sẽ hình thành trên bề mặt môi trường.
3.2.2 Phương pháp nuôi cấy, làm thuần
Khuẩn lạc trên đĩa petri được cấy chuyển sang môi trường PDA mới để nuôi cấy.
Dùng tăm đã khử trùng cấy chấm điểm trên bề mặt đĩa thạch. Sau đó được đặt vào tủ nuôi 30°C trong 2-4 ngày. Tiếp tục cấy chuyển đến cho đến khi chúng được làm thuần.
3.2.3. Phương pháp giữ giống
Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng:
Các chủng nấm sau đi được làm thuần thì sẽ được cấy trên môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm để giữ giống. Các chủng được cấy trên bề mặt thạch nghiêng theo kiếu zíc zắc và ni ở 30ºC trong 4 ngày. Ống giống được
bảo quản ở 4ºC, cấy chuyển hàng tháng và được hoạt hóa trước khi nhân giống. Giữ giống trong glycerol
Giống được giữ trong ống eppendoft bằng glycerol 20% với tỷ lệ 20µl glycerol: 80µl nước cất (glycerol và nước cất đã được hấp khử trùng). Các chủng được dùng tăm đã vô trùng cấy vào và được bảo quan ở 4ºC, cấy chuyển hàng tháng và được hoạt hóa trước khi nhân giống.
3.2.4. Phương pháp lây nhiễm nhân tạo
Nuôi lỏng tĩnh các chủng nấm sợi trong môi trường PDA lỏng, thời gian 3- 4 ngày trong nhiệt độ 30oC, sau đó dùng dao gây vết thương nhân tạo trên các quả thể nấm Linh chi, hút dịch nấm sợi ( đã ni lỏng trước đó) nhỏ lên vết thương nhân tạo. Theo dõi kết quả sau từng ngày tái lây nhiễm, thí nghiệm lặp lại 3 lần.
3.2.5. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học
Tiến hành quan sát trực tiếp chủng nấm mốc trên môi trường PDA bằng
mắt thường và quan sát dưới kính hiển vi quang học.
Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng nấm trên PDA
Khả năng phát triển của khuẩn lạc Màu sắc tản nấm
Hình dạng tản nấm Bề mặt tản nấm Kích thước tản nấm
Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng nấm gây bệnh dưới kính hiển vi quang học.
Cấy các chủng nấm sợi vào các đĩa peptri có chứa mơi trường PDA, sau đó lấy 1 tấm lamen vơ trùng đặt nghiêng 1 góc 30-45ºC so với bề mặt thạch, ni ở nhiệt độ phịng 2-3 ngày.
Sau 2-3 ngày lấy lá kính ra nhỏ vào 1 giọt dầu kính và quan sát hình thái nấm sợi bằng kính hiển vi ở vật kính × 40 và × 100.
Tiến hành quan sát đặc điểm sợi nấm, bào tử, các đặc điểm của bào tử
Nhân sinh khối các chủng nấm.
Trước khi thử hoạt tính ta cần ni nấm để lấy dịch nhỏ. Nuôi nấm trong môi trường PDA 2-3 ngày.
Dùng tăm đã khử trùng cạo lấy sợi nấm cho vào bình tam giác hoặc lọ đã có sẵn mơi trường PDA lỏng đã được hấp khử trùng.
Đem nuôi lắc trong 1-2 ngày để lấy dịch nấm.
3.2.6. Phương pháp định loại nấm sợi (Nguyễn Lân Dũng, 2006) Yêu cầu: Yêu cầu:
Có được các chủng nấm sợi thật thuần khiết (không được lẫn tạp nấm hoặc các vi sinh vật khác).
Các chủng cần định loại phải được nuôi cấy trên các môi trường, nhiệt độ, thời gian ni cấy theo đúng quy định của các khố phân loại đối vối từng chi nấm mốc.
Quy trình định loại một chủng nấm sợi:
Quan sát đặc điểm phân loại của chủng nấm sợi cần định loại. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc trên thạch.
- Hình dáng
- Kích thước (đường kính, chiều dày)
- Dạng mặt (nhung mượt, mịn, len xốp, dạng hạt, lồi lõm, có khía hay khơng…)
- Màu sắc khuẩn lạc mặt trên và mặt dưới
- Dạng mép khuẩn lạc (mỏng, dày, phẳng, nhăn nheo…) - Giọt tiết nếu có (nhiều, ít, màu sắc)
- Mùi khuẩn lạc (có, khơng mùi)
- Sắc tố hồ tan (màu của mơi trường xung quanh khuẩn lạc) nếu có.
o Các cấu trúc khác: bó sợi, bó giá (Synnematous or sporodochial conidiomata) các cấu trúc mang bào tử trần (Fruit body - conidiomata) như đĩa giá (acervuli) hoặc túi giá (Pycnidia), đệm nấm (Stroma), hạch nấm (sclerotia) vv..
Quan sát các đặc điểm vi học
- Sợi nấm: (hyphae) có vách ngăn, khơng có vách ngăn, có mấu.
- Bào tử trần(conidia): kiểu phát sinh bào tử trần (ở nấm bất tồn), hình dạng, kích thước, màu sắc, bề mặt (nhẵn, có gai, gồ ghề) cách sắp xếp đơn độc chuỗi gốc non (basipetal) chuỗi gốc già (acropetal) khối cầu vv…
(nếu có) (Sporangia & Sporangiola) hình dáng, kích thước, màu sắc, bề mặt của nang, cuống nang, khơng hoặc có nhánh (nhánh mọc vịng, mọc cách, hợp trục vv…); bào tử nang ( hình dạng, kích thước, bề mặt, …) ở nấm tiếp hợp.
- Bộ máy mang bào tử trần (conidiogenous apparatus): giá bào tử trần (conidiophore) - kích thước, đường kính, chiều dài, bề mặt (nhẵn, có gai, có nốt sần, vv…) màu sắc, có vách ngang hoặc khơng, có hoặc khơng có cấu trúc đặc biệt như tế bào chân (foot cell) sợi cứng (setae) tăng trưởng ở gốc hoặc ở ngọn có hoặc khơng có dạng hình thái đặc biệt như bó giá, đệm giá. Các nhánh (của bào tử trần) số lượng nhánh, kích thước bề mặt, màu sắc, cách sắp xếp (đối xứng, không đối xứng sát nhau hoặc tẽ rộng, vị trí dọc giá bào tử trần hoặc tập trung ở ngọn giá)vv…
- Tế bào sinh bào tử trần (conidiogenous cell)
Kiểu tế bào sinh bào tử trần (thể bình, dạng có khuyên ở đỉnh, dạng sinh bào tử trần đồng thời, như dạng (dạng bình- phialo type; dạng phân đốt, Annello type). Dạng sinh bào tử trần khơng đồng thời (Aleurio- type), bào tử đính kiểu nảy chồi (Blasto - type), dạng sinh bào tử trần qua lỗ để lại sẹo (Poro - type) vv.. hình dạng, kích thước, màu sắc, cách sắp xếp (đơn dộc hoặc thành cụm, thành vịng), vị trí (trên sợi nấm, dọc theo giá bào tử trần, các nhánh hoặc ở đính giá) vv…
- Thể quả túi (ascocarp) như cleistothecium, cần khảo sát vị trí, số lượng, hình dạng, kích thước, màu sắc, bề mặt của thể quả, quan sát túi bào tử (ascus) bào tử túi (ascospore) về hình dạng, kích thước bề mặt.
Tiến hành định loại
Căn cứ vào kết quả quan sát đầy đủ, chính xác các đặc điểm của khuẩn lạc và các đặc điểm vi học tiến hành xác định tên lồi (hoặc thứ nếu có) chủng nấm mốc như sau:
Dùng khố phân loại của các nhóm phân loại bậc cao (ngành, ngành phụ, lớp, bộ, họ, chi) để xác định lần lượt xem những nấm mốc thuộc chi nấm mốc nào. Tiếp theo dùng khoá phân loại của chi đó để xác định đến lồi (thứ) bằng cách so sánh tất cả các đặc điểm đã quan sát được của chủng nấm mốc đó với các đặc điểm tương ứng của lồi nào đó trong khố phân loại. Nếu các đặc điểm so sánh phù hợp với đặc điểm của lồi mơ tả trong khố, ta xác định được tên lồi của chủng nấm mốc cần định loại.
Nếu có chủng nấm mẫu của lồi (hoặc thứ) vừa xác định thì tiến hành so sánh các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm vi học của chủng mẫu với các đặc điểm tương ứng của chủng cần định loại. Nếu các đặc điểm của 2 chủng phù hợp với nhau thì có thể khẳng định chắc chắn loài (hoặc thứ) của chủng nấm mốc cần định loại.
Nếu có chủng nấm mẫu của lồi (hoặc thứ) vừa xác định thì tiến hành so sánh các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm vi học của chủng mẫu với các đặc điểm tương ứng của chủng cần định loại. Nếu các đặc điểm của 2 chủng phù hợp với nhau thì có thể khẳng định chắc chắn loài (hoặc thứ) của chủng nấm mốc cần định loại.
3.2.7. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Cho 150 µl đệm chiết vào ống eppendorf đã chuẩn bị sẵn
Dùng tăm nhọn lấy mẫu nấm bệnh cho vào ống eppendorf bên trên ( Lượng lấy cỡ đầu một que diêm)
Dùng chày nhựa nghiền nát sinh khối sợi nấm trong ống eppendorf Bổ sung thêm 450µl đệm chiết vào ống eppendorf bên trên
Hỗn hợp được trộn đều, đem ủ ở 60°C trong 30 phút đến 1 giờ
Sau đó bổ sung thêm 200µl natri acetate 5M, trộn đều và ly tâm ở 12000v/phút, trong 30 phút, ở 4°C
Dịch nổi được chuyển sang một ống Eppendorf mới và bổ sung isopropanol lạnh để tủa DNA. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Sau đó đem ly tâm ở 12000v/phút, 15 phút, 4°C
Đổ bỏ phần dịch trong nhẹ nhàng, tủa được rửa trong 1000µl ethanol 70% Ly tâm ở 10000v/phút, 10 phút, 4°C, sau đó để khơ và bổ sung thêm 50µl TE
Sản phẩm được điện di trên gel agarose 1% được chuẩn bị bằng đêm TAE và chứa 0,5 mg/mL ethidium bromide.
Phản ứng PCR nhân trình tự
Khuếch đại vùng bảo thủ của ITS rRNA với cặp mồi có. Trình tự cặp mồi:
ITS1 : 5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ITS4 : 5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
Thành phần phản ứng: Nước : 6µl Master mix (2X) : 10µl ITS1 : 1µl ITS4 : 1µl AND : 2µl Tổng thể tích : 20µl
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:
- Biến tính: 95°C - 5 phút.
- Tiếp đến 30 chu kỳ: 94°C – 1 phút, 60°C – 30 giây, 72°C – 1phút. - Tổng hợp cuối cùng:. 72°C – 7 phút.
- Bảo quản ở 4°C.
Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0.8%. Đun tan 0.8% agarose (dung dịch TBE 10X 8ml, nước cất 2 lần 72ml,agarose 0.64g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong dung dịch TBE 1X. Nhỏ mẫu DNA vào giếng và chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cường độ dòng điện 90 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr 20 phút. Vớt ra và quan sát trong máy soi gel.
- Phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại
Mức độ tương đồng về trình tự gen mã hóa ITS rARN của chủng nghiên cứu được so sánh với các chủng đã công bố trên ngân hàng gen sử dụng công cụ tra cứu Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), công cụ ClustalX2 và phần mềm MEGA7.
Sử dụng đoạn trình tự gen của chủng nghiên cứu, sử dụng cơng cụ Blast để tìm và chọn ra các chủng chuẩn đã cơng bố có mức độ tương đồng cao với chủng nghiên cứu. Truy cập vào cơ sở dữ liệu DNA của ngân hàng gen để tải các trình tự đó về. Căn trình tự để nhận biết các đoạn trình tự giống nhau giữa trình tự DNA truy vấn và trình tự DNA của các loài đã biết trên ngân hàng gen.
Tiến hành xây dựng cây phân loại dựa trên trình tự gen đã được định dạng đúng với phần mềm. Sử dụng phần mềm MEGA7 để xây dựng cây xác định mối
quan hệ di truyền, lựa chọn phương pháp Maximum Parsimony với độ tin cậy được tính bằng thuật tốn Bootstrap với 1000 lần lặp lại. Dựa vào cây phân loại và giá trị bootstrap để xác định mối quan hệ di truyền của chủng nghiên cứu. 3.2.8. Vi sinh vật
3.2.8.1. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với vi nấm gây bệnh trên nấm Linh chi
► Phương pháp nuôi cấy
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause-1 và ISP2 Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường LB
Các chủng vi sinh vật được bảo quản trong dung dịch glycerol 30% ở điều kiện -21°C. Trước khi thử khả năng đối kháng tiến hành hoạt hóa trên mơi trường Gause-1, LB sau đó cấy chuyển 1-2 lần mới tiến hành thử.
► Thử khả năng đối kháng vi nấm gây bệnh trên nấm Linh chi bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Dhanasekaran et al., 2012):
- Bước 1: Nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trường ISP2 lỏng lắc 200