Chương 2 : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp phân loại hình thái thực vật và phân tích sinh hóa hạt
2.4.1.1. Phương pháp phân loại hình thái thực vật
Các giống đậu tương Cúc bóng được thu thập tại các xã Bình Long, Phương Dân Tiến, Phương Giao huyện Võ Nhai, được trồng khảo nghiệm ở cùng một điều kiện canh tác. Phương pháp thực hiện theo QCVN 01-58:2011/BNNPTNT “Về khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dụng giống đậu tương”. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: Thời gian sinh trưởng, chiều cao cây, số lượng hoa, quả, hạt trên cây, trọng
Mô tả hình thái cây đậu tương dựa trên phương pháp của Ngô Thế Dân[1], và Trần Văn Điền [2], các bộ phận mô tả bao gồm: thân, lá, rễ, hoa, quả và hạt.
2.4.1.2. Phương pháp phân phân tích sinh hóa hạt
Phân tích các chỉ tiêu sinh hóa hạt đậu tương được thực hiện tại phòng Phân tích hóa học – Viện Khoa học Sự sống – Đại học thái Nguyên.
* Xác định hàm lượng Protein
Phương pháp xác định: Theo TCVN 4328-1:2007
Mẫu thử nghiệm được vô cơ hóa bằng H2SO4 98% kết hợp với chất xúc tác để chuyển Nitơ hữu cơ ra dạng vô cơ (NH4)2SO4, rồi dùng NaOH để đẩy NH3 ra khỏi muối Amoni, NH3 sau khi được giải phóng ra sẽ được cuốn đi bằng dòng hơi nước nóng. Sau khi được làm nguội sẽ được hấp thụ vào dung dịch H3BO3 ở trong bình hứng tạo ra muối borat amon có mầu xanh trong.
(NH4)2SO4 + 2NaOH = NH3 + Na2SO4 + H2O NH3 + H3BO3 = (NH4)3BO3
Để xác định được lượng amoniac (NH3) giải phóng ra trong quá trình chưng cất được đem đi chuẩn độ bằng dung dich H2SO4 0,1N đến khi nào dung dịch chuyển sang mầu tím nhạt.
(NH4)3BO3 + H2SO4 = (NH4)2SO4 + H3BO3
Từ lượng axit H2SO4 0,1N tiêu tốn trong quá trình chuẩn độ chúng ta tính được lượng protein có trong mẫu.
* Axit amin
Phương pháp xác định: Theo TCVN 8764:2010
Các axit amin tự do được chiết với dung dịch axit clohydric loãng. Các chất đồng chiết xuất có phân tử lượng lớn chứa nitơ được kết tủa với axit sulfosalicylic và được loại bằng cách lọc. Dịch lọc được điều chỉnh pH tới 2,20. Axit amin được tách bằng sắc ký trao đổi ion và xác định bằng phản ứng với ninhydrin sử dụng detector quang đo ở bước sóng 570 nm.
* Hàm lượng lipit
Việc xác định chất béo dựa vào hàm lượng chất béo được rút ra khỏi mẫu bằng các dung môi hữu cơ. Chiết xuất chất béo ra khỏi nguyên liệu bằng cách đun trực tiếp trong dung môi hữu cơ và rửa rải cho đến hết chất béo ra khỏi nguyên liệu.
Cân khoảng 2-3 g mẫu (m1) đã được nghiền nhỏ cho vào túi giấy lọc, gấp kín mép túi sao cho mẫu không bị rơi vãi, sấy lại túi giấy có chứa mẫu ở nhiệt độ 1050C đến khi khối lượng không đổi (m2). Đặt bình cầu lên bếp điện và cho ether petro vào 1/2 thể tích bình, lắp trụ chiết đã có sẵn các túi mẫu vào bình cầu, cho ether petro vào bình chiết đến ngập túi nguyên liệu và ngâm qua đêm.
Thời gian chiết xuất lipid kéo dài khoảng 6-8 giờ cho đến khi hết lipit trong mẫu (thử bằng cách lấy vài giọt ether từ đầu cuối trụ chiết nhỏ lên mặt kính đồng hồ sạch, cho bay hết ete nếu không có vết lipid trên mặt kính thì lipid đã được chiết hoàn toàn).
Sau khi đã chiết hết chất béo ta lấy túi giấy lọc đựng mẫu ra cho vào sấy, đến khối lượng không đổi, ghi lại khối lượng bao để tính toán kết quả (m3).
Hàm lượng chất béo trong mẫu khô được tính theo công thức sau: W = (m2-m0) - (m3 – m0) x 100 (m2 – m0) * Hàm lượng khoáng Phương pháp xác định: TCVN 8124 : 2009
Cân khoảng 0,5 -2g mẫu đã nghiền cho vào chén đã được chuẩn bị. Sấy phần mẫu thử trong chén ở nhiệt độ gần 100oC cho đến khi hết ẩm. Chuyển chén vào lò nung và nung ở 525oC ± 25oC cho đến khi tro hoá hoàn toàn. Để nguội, và làm ẩm tro bằng nước cất, làm khô trên nồi hơi, sau đó trên bếp điện. Đưa chén trở lại lò nung và nung trong 60 phút, làm nguội trong bình hút ẩm và cân. Nung tiếp trong lò nung 30 phút, để nguội và cân.
Cân 5 - 20g mẫu, chuyển toàn bộ vào bình tam giác dung tích 250ml, tráng kỹ cốc cân bằng nước cất, lượng nước cho vào bình khoảng 100 - 150ml. Thêm 5ml axit clohydric đặc vào bình khoảng 100 - 150ml. Thêm 50ml axit clohydric đặc vào bình mẫu, đậy nút cao su có cắm ống sinh hàn ngược và đun trên bếp cách thủy sôi trong 2 giờ. Lấy bình ra làm nguội, trung hòa mẫu bằng natri hydroxit 30%, khử protit, lọc, định mức. Hút 5 - 25ml dịch lọc, chuyển vào bình tam giác dung tích 250ml, thêm vào bình 50ml hỗn hợp pheling A, B và tiếp tục đun, lọc, hòa tan và chuẩn độ. Ghi số ml kali pemanganat 0,1N đã dùng.