STT Hóa chất Thể tích (µl) 1 H2O 14,7 2 PCR Buffer 10X 2 3 dNTP 10mM 0,4 4 Mồi phản ứng PCR 0,8 5 Taq polymerase 0,1 6 DNA khuôn 2 Tổng thể tích 20
DNA tổng số được tách chiết sẽ được sử dụng làm khuôn cho phản ứng khuếch đại đoạn gen rbcL và ITS2.
Các thành phần phản ứng được trộn đều, sau đó đặt vào máy PCR với chu trình nhiệt của phản ứng PCR được thực hiện như sau:
Hình 2.1: Sơ đồ chu trình nhiệt PCR
Sản phẩm sau phản ứng PCR được kiểm tra trên gel agarose 1%. Kích thước của các đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được so sánh với thang DNA chuẩn (Fermentas).
2.4.2.4. Phương pháp xác định trình tự gen chỉ thị ITS2, rbcL của mẫu nghiên cứu
- Giải trình tự là phương pháp để xác định thứ tự sắp xếp của 4 nucleotide (adenine, guanine, cytosine và thymine) trên một phân tử DNA. Với sự phát triển của phương pháp giải trình tự và phân tích tự động việc xác định trình tự DNA đã
trở nên dễ dàng hơn. Các thông tin về trình tự DNA hệ gene của sinh vật đã trở nên không thể thiếu cho các quá trình nghiên cứu sinh học cơ bản, cũng như trong các lĩnh vực chẩn đoán hoặc pháp y.
- Các sản phẩm PCR sau khi được khuếch đại sẽ được gửi đi giải trình tự. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM – DNA Purification (Invitrogen) và giải trình tự trên hệ thống ABI PRISM 3100 Avant Gentic Analyzer theo nguyên lý của Sanger với bộ kit BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing (công ty 1st BASE tại Singapore), sử dụng cặp mồi ITS2R/ ITS2F và cặp mồi
rbcLR/ rbcLF.
Xây dựng sơ đồ cây thể hiện mối quan hệ di truyền giữa giống đậu tương nghiên cứu với các giống đậu tương khác trên thế giới và Việt Nam
- Tổng hợp dữ liệu về các chỉ thị phân tử của đậu tương đã công bố. Trình tự gene rbcL và ITS2 của các mẫu nghiên cứu sau khi giải trình tự được so sánh với trình tự các trình tự rbcL và ITS2 đã được công bố trên thư viện mã vạch BOLD và NCBI thông qua phần mềm Bioedit,Seqscanner v1.0.
- Xây dựng sơ đồ cây thể hiện mối quan hệ di truyền giữa giống đậu tương nghiên cứu với các giống đậu tương khác trên thế giới bằng phần mềm chuyên dụng DNAstar 2.0.
2.4.3. Đăng kí trình tự gen chỉ thị đậu tương nghiên cứu trên ngân hàng gen quốc tế quốc tế
Trình tự gen chỉ chị rbcL và ITS2 được đăng ký trực tuyến trên ngân hàng gen NCBIdựa trên các thông tin của đề tài nghiên cứu.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả đánh giá đặc điểm hình thái của đậu tương Cúc bóng tại huyện Võ Nhai tỉnh Thái Nguyên Nhai tỉnh Thái Nguyên
Sau khi thu thập mẫu và gieo trồng đánh giá hình thái cây đậu tương Cúc bóng chúng tôi thu được kết quả như sau:
Thân cây thuộc thân thảo, có hình tròn, trên thân có nhiều lông nhỏ mọc dày bao phủ từ gốc lên đến ngọn, đến cả cuống lá. Thân khi còn non có màu xanh khi về già chuyển sang màu nâu nhạt. Thân có trung bình 13-14 lóng (đốt), các lóng ở phía dưới thường ngắn, các lóng ở phía trên thường dài, có chiều cao từ gốc tới ngọn là 35-55 cm. Thân dạng bán đứng, trong điều kiện nghèo dinh dưỡng thân có kích thước nhỏ hơn và cho dạng thân leo.
Rễ cây có rễ chính và rễ phụ. Rễ chính có thể ăn sâu 25-50 cm. Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ phụ, rễ phụ cấp 2, cấp 3 tập trung nhiều ở tầng đất 8-9 cm. Trên rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần, nốt sần ở rễ đậu tương thường tập trung ở tầng đất 0-20 cm. Từ trên 20 nốt sần ít dần và nếu sâu hơn nữa thì có ít hoặc không có. Nốt sần đóng vai trò chính trong quá trình cố định đạm khí trời cung cấp cho cây, khi mới hình thành kích thước nhỏ và có màu trắng sữa, khi phát triển tốt cho màu hồng.
Cây có 3 loại lá: Lá mầm (lá tử diệp): Lá mầm mới mọc có màu xanh lục, khi tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu xanh. Lá nguyên (lá đơn): Lá nguyên xuất hiện sau khi cây mọc từ 2-3 ngày và mọc phía trên lá mầm. Lá đơn mọc đối xứng nhau. Lá kép: Mỗi lá kép có 3 lá chét; Lá kép mọc so le, lá kép thường có màu xanh tươi khi già biến thành màu vàng nâu. Trên lá có nhiều lông tơ. Lá có hình dạng trứng nhọn, số lá nhiều to khoẻ nhất vào thời kỳ đang ra hoa rộ.
Hình 3.1: Hình thái cây đậu tương Cúc bóng Hình 3.2: Rễ và nốt sần đậu tương Cúc bóng
Hoa đậu tương Cúc bóng nhỏ, không hương vị, thuộc loại cánh bướm. Màu sắc của hoa có màu tím nhạt, hoa phát sinh ở nách lá, đầu cành và đầu thân. Hoa mọc thành từng chùm, mỗi chùm có từ 1-10 hoa thuộc loại hoa đồng chu lưỡng tính trong hoa có nhị và nhụy, mỗi hoa gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa có 10 nhị và 1 nhụy. Đài hoa có màu xanh, nhiều bông; cánh hoa: một cánh to gọi là cánh cờ, 2 cánh bướm và 2 cánh thìa; nhị đực: 9 nhị đực cuốn thành ống ôm lấy vòi nhuỵ cái và 1 nhị riêng lẻ; nhụy cái: Bầu thượng, tử phòng một ngăn có 1-4 tâm bì (noãn) nên thường quả đậu tương có 2-3 hạt.
Các bộ phận hoa hình thành như sau: trước tiên là vòi đài, trong đó có cánh đài phía trước hình thành đầu tiên sau đó là 2 cánh đài bên và cuối cùng là 2 cánh sau. Sau khi đài hoa hình thành, tiếp đến là tràng hoa. Ở tràng hoa có 2 cánh thìa hình thành trước sau đó đến 2 cánh bên cạnh và cuối cùng là cánh cờ, mầm cánh hoa phát triển chậm sau đó nhụy vượt lên. Các nhị ra trước xen kẽ với nhị ra sau bao quanh nhụy đang phát triển. Chiếc nhị tự do là cái xuất hiện sau cùng, nằm giữa cánh hoa cờ và đường nối của phần bụng của nhụy. Khi nhị phát triển, trên đầu của nó hình thành một bao phấn xẻ bốn thùy và một sợi ngắn.
Quả đậu tương Cúc bóng hơi cong, có chiều dài từ 2 tới 7 cm. Quả có màu sắc biến động từ vàng trắng tới vàng sẫm, nâu hoặc đen. Lúc quả non có màu xanh nhiều lông (có khả năng quang hợp do có diệp lục) khi chín có màu nâu vàng. Số quả biến động từ 31 - 40 quả trên một cây. Vỏ của lớp quả non gồm nhiều lông dần dần những lông dạng chùy tiêu biến, những lông có ria cứng tồn tại tới lúc quả già. Trước khi quả mở ra, ở trên hai đường nối xuất hiện vết nứt, sau đó 2 nửa quả bong ra và xoăn lại theo đường trục của nó.
Hạt: Một quả chứa từ 1- 3 hạt, hạt có hình dạng tròn (hình bầu dục, hoặc tròn dẹt), vỏ hạt đậu tương Cúc bóng có 3 lớp rõ ràng: biểu bì, hạ bì và lớp nhu mô bên trong, màu vỏ hạt màu vàng bóng, khối lượng trung bình 100 hạt l2g - 13,5g. Rốn hạt có màu nâu sậm.
Hình 3.7: So sánh kích thước hạt đậu tương Cúc bóng và DT 84