Chương 2 : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.2. Phương pháp xác định mối quan hệ di truyền
2.4.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
DNA đậu tương Cúc bóng được tách chiết DNA từ mô lá, dựa trên phương pháp tách chiết của Dellaporta cùng các cộng sự (1983) [10] và Doyle (1990) [11].
Quy trình thực hiện như sau:
+ Bước 1: Nghiền 0,02g mẫu (lá cây) với 500 µl đệm CTAB, chuyển hỗn hợp vào ống effendorf và ủ ở 65ºC trong 1 giờ.
+ Bước 2: Bổ sung 500 µl dung dịch CIAA (24 Chloroform: 1 Isoamyl alcohol), đảo trộn nhẹ nhàng trong 1 phút.
+ Bước 3: Ly tâm hỗn hợp trong 10 phút với tốc độ 15000 xg, chuyển pha trên sang một ống effendorf mới.
+ Bước 4: Ước tính khối lượng của pha lỏng. Kết tủa DNA bằng cách thêm 0,08 khối lượng Kali Acetate và 0,54 khối lượng của Isopropanol lạnh.
+ Bước 5: Ủ hỗn hợp ở -20oC trong 1 giờ.
+ Bước 6: Ly tâm với tốc độ 15000 xg trong 6 phút và loại bỏ dịch nổi để thu hồi kết tủa DNA.
+ Bước 7: Rửa tủa với 700 µl ethanol 70% lạnh và ly tâm trong 3 phút. + Bước 8: Loại bỏ dịch nổi và giữ lại kết tủa DNA
+ Bước 9: Rửa kết tủa DNA lại lần thứ 2 với 700 µl ethanol 95% lạnh và ly tâm ở tốc độ tối đa trong 3 phút.
+ Bước 10: Loại bỏ dịch nổi và giữ lại kết tủa DNA. Để khô kết tủa. + Bước 11: Hòa tan kết tủa bằng 50µl đệm TE 1X.
2.4.2.2. Phương pháp điện di DNA trong gel agarose
Phương pháp điện di DNA dựa vào đặc tính của các nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác dụng của lực điện trường với điện thế và cường độ thích hợp chúng sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường. Phương pháp điện di được thực hiện phụ thuộc vào kích thước, cấu hình của DNA, loại gel, nồng độ gel và cường độ dòng điện. Các phân tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển về phía cực dương nhanh hơn các phân tử có kích thước lớn.
Các bước của phương pháp điện di được tiến hành như sau: Chuẩn bị gel:
+ Cân 1 gam agarose cho vào 100 ml dung dịch TAE 1X, đun sôi trong lò vi sóng sao cho agarose tan hoàn toàn.
+ Để gel nguội đến 60oC, đổ gel vào khuôn đã cài sẵn lược và chờ gel đông + Nhấc lược khỏi bản gel và đặt bản gel vào bể điện di.
+ Đổ dung dịch đệm TAE vào bể điện di sao cho ngập bản gel. Tra mẫu điện di:
+ Tỷ lệ tra: Trộn theo tỉ lệ 1 µl loading dye với 5 µl mẫu.
+ Cài đặt chương trình điện di ở hiệu điện thế 80-110 V, 100 mA, trong 35 phút (khi vị trí vạch mầu chạy được khoảng 2/3 bản gel).
Nhuộm gel:
+ Bản gel được lấy ra khỏi bể điện di và nhuộm với ethidium bromide (nồng độ 30 µl/l) trong 15 phút.
+ Soi và chụp ảnh bản gel bằng máy chụp ảnh gel.
2.4.2.3. Phương pháp khuếch đại các gen chỉ thị ITS2, rbcL từ DNA tổng số của các mẫu đậu tương thu thập (PCR)
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR STT Hóa chất Thể tích (µl) STT Hóa chất Thể tích (µl) 1 H2O 14,7 2 PCR Buffer 10X 2 3 dNTP 10mM 0,4 4 Mồi phản ứng PCR 0,8 5 Taq polymerase 0,1 6 DNA khuôn 2 Tổng thể tích 20
DNA tổng số được tách chiết sẽ được sử dụng làm khuôn cho phản ứng khuếch đại đoạn gen rbcL và ITS2.
Các thành phần phản ứng được trộn đều, sau đó đặt vào máy PCR với chu trình nhiệt của phản ứng PCR được thực hiện như sau:
Hình 2.1: Sơ đồ chu trình nhiệt PCR
Sản phẩm sau phản ứng PCR được kiểm tra trên gel agarose 1%. Kích thước của các đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được so sánh với thang DNA chuẩn (Fermentas).
2.4.2.4. Phương pháp xác định trình tự gen chỉ thị ITS2, rbcL của mẫu nghiên cứu
- Giải trình tự là phương pháp để xác định thứ tự sắp xếp của 4 nucleotide (adenine, guanine, cytosine và thymine) trên một phân tử DNA. Với sự phát triển của phương pháp giải trình tự và phân tích tự động việc xác định trình tự DNA đã
trở nên dễ dàng hơn. Các thông tin về trình tự DNA hệ gene của sinh vật đã trở nên không thể thiếu cho các quá trình nghiên cứu sinh học cơ bản, cũng như trong các lĩnh vực chẩn đoán hoặc pháp y.
- Các sản phẩm PCR sau khi được khuếch đại sẽ được gửi đi giải trình tự. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM – DNA Purification (Invitrogen) và giải trình tự trên hệ thống ABI PRISM 3100 Avant Gentic Analyzer theo nguyên lý của Sanger với bộ kit BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing (công ty 1st BASE tại Singapore), sử dụng cặp mồi ITS2R/ ITS2F và cặp mồi
rbcLR/ rbcLF.
Xây dựng sơ đồ cây thể hiện mối quan hệ di truyền giữa giống đậu tương nghiên cứu với các giống đậu tương khác trên thế giới và Việt Nam
- Tổng hợp dữ liệu về các chỉ thị phân tử của đậu tương đã công bố. Trình tự gene rbcL và ITS2 của các mẫu nghiên cứu sau khi giải trình tự được so sánh với trình tự các trình tự rbcL và ITS2 đã được công bố trên thư viện mã vạch BOLD và NCBI thông qua phần mềm Bioedit,Seqscanner v1.0.
- Xây dựng sơ đồ cây thể hiện mối quan hệ di truyền giữa giống đậu tương nghiên cứu với các giống đậu tương khác trên thế giới bằng phần mềm chuyên dụng DNAstar 2.0.