(D1-D12: 10 mẫu đậu tương Cúc bóng nghiên cứu)
Kết quả cho thấy, vùng gen khuếch đại không có sự sai khác giữa các trình tự
ITS2 trong nội bộ các mẫu đậu tương Cúc bóng phân tích. Không có sự biến dị, mất nucleotide hay đột biến. Trình tự gen ITS2 của mẫu đậu tương Cúc bóng được so sánh với với các dữ liệu đã được công bố tại ngân hàng mã vạch DNA (NCBI) bằng ứng dụng BLAST. Kết quả được tổng hợp trên hình 3.8 và bảng 3.4 bằng phần mềm Bioedit, DNAstar phiên bản 2.0.
Hình 3.15. Kết quả so sánh trình tự nucleotide chỉ thị ITS2 của mẫu đậu tương Cúc bóng và các loài chi Glycine
Bảng 3.6: Hệ số tương đồng trình tự gen ITS2 của mẫu đậu tương Cúc bóng với trình tự trên ngân hàng mã vạch DNA
Chúng tôi lựa chọn các mã số trình tự lần lượt là JX546295.1, JX546294.1, U60548.1, U60547.1, U60537.1, U60533.1, U60546.1, U60543.1, U60534.1, U60550.1 đại diện cho các loài Glycine tomentella, Glycine tabacina, Glycine
cyrtoloba, Glycine curvata, Glycine microphylla, Glycine canescens, Glycine
JN617195.1, MH688901.1 thuộc loài Glycine max của Đài Loan, vùng Địa Trung Hải và Canada có mức tương đồng cao với mẫu đậu tương nghiên cứu để tiến hành phân tích (không tìm thấy dữ liệu trình tự ITS2 của các giống đậu tương Việt Nam được công bố trên ngân hàng gen NCBI hay ngân hàng mã vạch Boldsystems).
Kết quả cho thấy mẫu đậu tương Cúc bóng có mức tương đồng tới 100% với cả 3 mã số trình tự thuộc loài Glycine max, 99,7% với loài Glycine soja với mức sai khác là 0,3% (một nucleotide) và từ 4%-7% với các loài còn lại. Kết quả này tương đồng với kết quả nghiên cứu của Kollipara và cộng sự, khi ông so sánh 18 loài thuộc chi đậu tương Glycine trong vùng gen nhân ITS sự sai khác giữa loài Glycine max với Glycine Soja dao động trong khoảng 0,2% (sai khác một nucleotide) và đến 8,6% với các loài như Glycine hirticaulis và Glycine falcata[15].
Theo tổ chức BOLD: Những phát sinh sai khác lớn hơn 2% thì có khả năng hình thành loài mới. Kết quả cho thấy giống đậu tương Cúc bóng, có mối quan hệ họ hàng gần gũi với các giống đậu tương của Đài Loan, vùng Địa Trung Hải và Canada, và có thể thuộc loài Glycine max (sai khác 0%) hoặc Glycine soja (sai khác 0,3%). Kết hợp với kết quả phân tích hình thái cho thấy cây đậu tương Cúc bóng có một số đặc điểm chung với loài Glycine max, khác với loài đậu tương hoang dã Glycine soja, điển hình nhưhình dáng cây loài Glycine max là thẳng hoặc bán đứng, trong khi loài
Glycine soja dạng bò hoặc leo. Như vậy có thể kết luận giống đậu tương Cúc bóng
thuộc loài Glycine max.
So sánh trình tự với 3 giống đậu tương trên thế giới cho thấy mặc dù vị trí địa lý khác nhau nhưng vùng gen ITS2 không có sự khác biệt giữa các giống (tương đồng 100%), mức đa hình thấp, mức bảo thủ trong loài cao, chỉ thị ITS2 phù hợp để giúp định danh các loài thuộc chi Glycine. Kết quả này cũng thấy trong nghiên cứu của Madesis và cộng sự khi tiến hành phân loại 25 loài thuộc chi Glycine bằng chỉ thị
ITS2, cho kết quả phân biệt thành công được giữa các loài là 100% [21]. Nhiều nghiên cứu cũng đưa ra, đây là vùng gen rất hữu hiệu trong việc phân loại đến cấp độ loài, đặc biệt các loài có mối quan hệ gần gũi như các loài thuộc cây họ cải, họ hoa hồng, họ hòa thảo, họ cói,...Tuy nhiên ở một số trường hợp lại cho hiệu quả thấp như ở họ phong lan [22], [24], [26].
Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên trình tự vùng gen ITS2 của 12 loài thuộc chi Glycine bằng phần mềm DNAstar phiên bản 2.0.
Hình 3.16: Cây phát sinh chủng loại các loài thuộc chi Glycine xây dựng dựa trên trình tự ITS2
Kết quả phân tích được thể hiện trên hình 4.7 cho thấy các mẫu nghiên cứu đều xuất phát chung một nguồn gốc (họ đậu Fabaceae, chi Glycine) và được chia thành 2 nhóm lớn.
+ Nhóm I gồm các giống đậu tương thuộc loài Glycine max: đậu tương Cúc bóng, đậu tương Đài loan (EU288921.1), giống đậu tương Địa Trung Hải (JN617195.1) và giống đậu tương Canada (MH688901.1), chúng có mối quan hệ gần gũi với loài Glycine soja.
+ Nhóm II gồm 10 mẫu, được chia thành hai phân nhóm
Phân nhóm II.a gồm 2 loài Glycine curvata và Glycine cyrtoloba (có mức tương đồng là 98,7%).
Phân nhóm II.b được chia thành 2 phân nhóm phụ nhỏ hơn. Một nhóm gồm các loài Glycine tomentella, Glycine tabacina, Glycine clandestina, Glycine
canescens. Phân nhóm phụ còn lại gồm: Glycine arenaria, Glycine pindanica,
Glycine albicans, Glycine microphylla.
3.3. Đăng ký trình tự gen chỉ thị lên ngân hàng gen quốc tế
Trình tự gen rbcL và ITS2 của giống đậu tương Cúc bóng được đăng ký trên ngân hàng gen NCBI với mã số lần lượt là MN625739 và MN224216.
KẾT LUẬN 1. Kết luận
- Giống đậu tương Cúc bóng Võ Nhai - Thái nguyên mang những đặc điểm hình thái chung của cây đậu tương, có những điểm khác biệt với các giống đối chứng về màu sắc hoa, màu vỏ quả khô khác, có mức tương đồng cao về hình thái với giống đậu tương DT84. Tuy nhiên kích thước hạt trung bình của đậu tương Cúc bóng nhỏ hơn, khối lượng 1000 hạt dao động trong khoảng 120-135g thấp hơn giống đậu tương DT84 từ 40-65g. Các chỉ tiêu về thời gian sinh trưởng, chiều cao cây không có sự khác biệt lớn.
- Hàm lượng protein trong đậu tương Cúc bóng là 36,57%, lipit 21,38%, khoáng 4,74%, gluxit 24,37%, chứa tới 17 loại axit amin, có chứa 8 loại axit amin không thay thế: isoleucine, leucine, lysine, valine, threonine, methionine, phenyl alanine, histidine.
- Khuếch đại thành công hai vùng gen chỉ thị rbcL và ITS2. Dựa trên sự phân tích vùng chỉ thị rbcL cho thấy đây là vùng gen có tính bảo thủ cao, có ý nghĩa trong việc xác định đậu tương Cúc bóng thuộc chi Glycine. Chỉ thị ITS2 cho thấy giống đậu tương Cúc bóng thuộc loài Glycine max với mức tương đồng là 100% với các giống đậu tương vùng Địa Trung Hải, Đài Loan, Canada, có mối quan hệ gần gũi với loài Glycine soja, mức tương đồng là 99,7% với mức sai khác là 0,3% (một nucleotide) và từ 4% - 7% với 10 loài còn lại thuộc chi Glycine.
- Trình tự gen rbcL và ITS2 của đậu tương Cúc bóng được đăng ký trên ngân hàng gen quốc tế NCBI có mã số là: MN625739 và MN224216.
2. Đề nghị
Kết hợp một số kỹ thuật phân tích quan hệ di truyền khác như SSR, AFLP, PCR-RAPD để đánh giá tính đa hình trong nguồn gen cây đậu tương Cúc bóng ngoài vùng gen ITS2 và rbcL.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
1. Trần Văn Điền, (2007), “Giáo trình cây đậu tương”, NXB Nông nghiệp.
2. Ngô Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào (1999), “Cây đậu tương”, NXB Nông nghiệp.
3. Lê Phương Dung, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hường (2007), “Đặc điểm hình thái, hóa sinh hạt của một số giống đậu tương địa phương tỉnh Sơn La”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 2:67-71.
4. Hoàng Đăng Hiếu (2016),“Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh”, Luận văn thạc sĩ ngành di truyền học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.
5. Hà Văn Huân, Phạm Minh Toại (2016), “Tạo dữ liệu DNA mã vạch cho loài Bách xanh (Calocedrus macrolepis Kurz) phục vụ giám định và nghiên cứu đa dạng di truyền”, Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, 20:136-142.
6. Phan Kế Long, Vũ Đình Duy, Phan Kế Lộc, Nguyễn Giang Sơn, Nguyễn Thị Phương trang, Lê Thị Mai Linh, Lê Thanh Sơn (2014), “Mối quan hệ di truyền của các mẫu sâm thu ở Lai Châu trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide vùng
MATK và ITS–rDNA”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 12(2): 327-337.
7. Nguyễn Thị Thanh Nga (2012), “Đánh giá tính đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm (Codonopsis sp) bằng kỹ thuật DNA mã vạch”, Luận văn thạc sĩ ngành di truyền học, Đại học khoa học tự nhiên. 8. Bùi Văn Thắng, Nguyễn Thị Hải Hà, Vũ Quang Nam, Nguyễn Thế Đại, Phan
Văn Quynh, Nguyễn Ngọc Ánh (2014), “Giám định một số loài nưa tại Thanh Hóa bằng các dẫn liệu hình thái và phân tử”, tạp chí khoa học và công nghệ, số 3-2017:9:17.
Tài liệu tiếng anh
9. Amandita, F. Y. (2015), “DNA Barcoding of Flowering Plants in Jambi, Indonesia”, Doctoral dissertation, Georg-August Universität of Göttingen. 10.Dellaporta, Stephen L., Jonathan Wood, and James B. Hicks (1983), “A plant DNA
11.Doyle, J. J., & Doyle, J. L.(1990), “Isolation of plant DNA from fresh tissue”,
Focus, 12(13), 39-40.
12. Fazekas, A. J., Fazekas, A. J., Kuzmina, M. L., Newmaster, S. G., & Hollingsworth, P. M. (2012), “DNA barcoding methods for land plants”,
Methods Mol Biol, 858, 223-252.
13.Group, CBOL Plant Working, et al (2009), "A DNA barcode for land plants", Proceedings of the National Academy of Sciences,106(31), 12794-12797. 14.Hebert, P. D.,Cywinska, A., Ball, S. L., & Dewaard, J. R.(2003), “Biological
identifications through DNA barcodes”, Proc Biol Sci, 270(1512), 313-321. 15.Hymowitz, T. (2008), “The history of the soybean”,AOCS Press, 1-31.
16.Kang Y., Deng Z., Zang R., & Long, W.(2017), “DNA barcoding analysis and phylogentic relationships of tree species in tropical cloud forests”, Scientific
reports, 7(1), 12564.
17.Kollipara, K. P., Singh, R. J., & Hymowitz, T. (1997), "Phylogenetic and
genomic relationships in the genus Glycine Willd. based on sequences from
the ITS region of nuclear rDNA". Genome, 40(1), 57-68.
18.Kress, W. J., & Erickson, D. L. (2008), “DNA barcodes: genes, genomics, and bioinformatics”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 105(8), 2761-2762.
19.Kris Hirst K. (2017). Soybeans (Glycine max) - The Plant History of the Marvelous Soybean: Why Do Domestic Soybeans Have Half the Genetic Diversity of Wild Ones?, https://www.thoughtco.com/plant-history-of-the- soybean-3879343, March 08, 2017.
20.Li, Yonghua, Ruan, J., Chen, S., Song, J., Luo, K., Lu, D., & Yao, H. (2010), “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”, Journal of Medicinal Plants Research 4(24), 2706-2709.
21.Madesis, P., Ganopoulos, I., Ralli, P., & Tsaftaris, A. (2012), “Barcoding the major Mediterranean leguminous crops by combining universal chloroplast and nuclear DNA sequence targets”, Genet Mol Res, 11(3), 2548-2558.
22.Maria L Kuzmina, Johnson, K. L., Barron, H. R., & Hebert, P. D. (2012), "Identification of the vascular plants of Churchill, Manitoba, using a DNA barcode library",BMC Ecology, 12(1), 25.
23.Newmaster, S. G., A. J. Fazekas, and S. Ragupathy (2006), “DNA barcoding in land plants: evaluation of rbcL in a multigen tiered approach”, Botany 84(3), 335-341.
24.Techen,Natascha, Parveen, I., Pan, Z., & Khan, I. A.(2014), “DNA barcoding of medicinal plant material for identification”, Curr Opin Biotechnol, 25, 103-110. 25.Xiaorong, et al (2011), “DNA barcodes for discriminating the medicinal plant
Scutellaria baicalensis (Lamiaceae) and its adulterants”, Biological and
Pharmaceutical Bulletin, 2011, 34.8: 1198-1203.
26.Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J. (2010), “Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants and animals”, PLoS ONE, 5(10), e 13102.
PHỤ LỤC