CHƢƠNG II PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp
2.2.6. Xác định tính chất lý hóa của xylanase
2.2.6.1. Nhiệt độ phản ứng tối thích
Phản ứng của dịch enzyme tinh sạch và cơ chất 0,5% xylan trong đệm potassium phosphat 20 mM, pH 6,5 được thực hiện ở các nhiệt độ khác nhau từ 37 - 80oC. Hoạt tính xylanase được xác định theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959) với thời gian ủ là thời gian phản ứng tối ưu.
Dịch enzym tinh sạch được ủ với các đệm potasium phosphat 20 mM có pH khác nhau từ 3,5-8,0, sau đó tiến hành xác định hoạt tính theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959), với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, pH 6,5 ở nhiệt độ và thời gian phản ứng tối ưu.
2.2.6.3. Xác định độ bền nhiệt độ
Dịch enzym tinh sạch được ủ từ 1, 5 và 24 giờ ở các nhiệt độ khác nhau từ 25, 37, 40, 50oC. Dịch enzym sau khi ủ được xác định hoạt tính theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959), với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, ở pH, nhiệt độ tối ưu.
2.2.6.4. Xác định độ bền pH
Dịch enzym tinh sạch được ủ với đệm potasium phosphat có nồng độ 20 mM với các pH khác nhau từ 4,0-8,0 sau các khoảng thời gian từ 1, 2, 8 và 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Hoạt tính còn lại được xác định theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959) với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, ở pH, nhiệt độ tối ưu.
2.2.6.5. Ảnh hưởng của chất tẩy rửa
Dịch enzym tinh sạch được ủ với các chất Tween 80, Tween 20, Trixton x100, SDS ở nồng độ 2% trong 1 giờ. Hoạt tính còn lại được xác định theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959) với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, ở pH, nhiệt độ và thời gian phản ứng tối ưu.
2.3.5.6. Ảnh hưởng của các dung môi
Dịch enzym tinh sạch được ủ với các dung môi: Methanol, ethanol, acetone, isopropanol, n-butanol trong 1 giờ. Hoạt tính còn lại được xác định theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959) với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, ở pH, nhiệt độ và thời gian phản ứng tối ưu.
Dịch enzym tinh sạch được ủ với các ion kim loại: Mg2+, Fe2+, Cu2+, Ca2+, Ag+, Ni+, K+, EDTA, Zn+, Hg+ với nồng độ 10 mM trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Hoạt tính còn lại được xác định theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959) với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, ở pH, nhiệt độ và thời gian phản ứng tối ưu.
2.2.6.8. Thủy phân arabinoxylan bằng enzyme xylanase
Sử dụng cùng số đơn vị hoạt độ (khoảng 1 U cho 1 mg mẫu araninoxylan) của mỗi một loại enzyme xylanase để thủy phân arabinoxylan trong 24 giờ ở 55οC, trong đệm CH3COONa 50 mM, pH 5. Dịch mẫu sau khi thủy phân được bất hoạt enzyme ở 100oC trong 10 phút.
2.2.6.9. Thủy phân cơ chất bằng enzyme xylanase
Cơ chất: Bột đậu tương, bột cám gạo, bột lõi ngô, bột bã mía, bột gỗ mục, Xylan. Pha 5 g bột cơ chất với 40ml đệm phosphate 20 mM, pH 6,5. Trộn 1000 μl cơ chất với 200μl enzyme, ủ ở 55οC, tại mỗi thời điểm 15-30-60-90 phút 250 μl dung dịch đun cách thủy 10 phút để dừng phải ứng. Sau đó li tâm 10000v/ phút trong 10 phút. Rồi thu dịch chấm sắc kí (10 μl).
2.2.6.10. Phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC Nguyên tắc:
Sắc ký bản mỏng bao gồm lớp gel mỏng tráng trên bề mặt kính hoặc nhôm, là pha cố định và hệ thống dung môi hay pha chuyển động được lựa chọn để tạo ra sự phân tách các chất chấm trên bản gel. Do các chất di chuyển với tốc độ nhanh chậm khác nhau nên chúng dần dần được tách ra khỏi nhau dưới dạng các vết trên bản mỏng. Để đánh giá khả năng phân tách của từng chất trên bản sắc ký người ta quan tâm đến giá trị Rf đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất trong hệ thống sắc ký, được tính bằng tỉ số giữa khoảng cách mà chất đó di chuyển được khỏi vệt xuất phát trên khoảng cách mà dung môi di chuyển được.
Rf = Trong đó:
a: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử
b: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến vạch mức cuối cùng mà dung môi chạy đến Kết quả phân tách các chất trên bản sắc ký có thể được hiển thị bằng các
phản ứng màu đặc trưng kèm theo việc so sánh với chất chuẩn. Khi việc phân tách các chất trong hỗn hợp không rõ ràng, người ta có thể thay đổi thành phần và/ hoặc tỷ lệ của các dung môi trong hỗn hợp dung môi sắc ký. Việc bổ sung các chất không phân cực cũng như tăng tỷ lệ của chúng sẽ tạo điều kiện cho các chất ít phân cực chạy nhanh hơn khỏi vạch xuất phát và ngược lại [3].
Tiến hành:
Dùng pipet loại nhỏ hoặc dùng ống chấm sắc ký có chia vạch thể tích (5-10 μl) để hút mẫu và chấm lên các vị trí đã được đánh dấu trên bản gel. Bản gel sau khi chấm mẫu được đặt vào hệ thống bình sắc ký có nắp đậy, trong đó có chứa dung môi hữu cơ. Mức dung môi luôn được giữ thấp hơn vạch xuất phát của mẫu. Dung môi sẽ theo lớp gel để chạy ngược lên và mang theo các chất cần phân tích. Khi vạch dung môi chạy đến gần mép trên của bản gel sắc ký thì phải làm ngừng quá trình sắc ký. Bản gel được lấy ra, làm khô dung môi và sau đó có thể cho chạy lại một vài lần tương tự, tùy thuộc vào sự tách bạch giữa các mẫu quan tâm [3]. Kết quả phân tách các chất trên bản sắc ký được hiển thị bằng phản ứng màu đặc trưng kèm theo việc so sánh với chất chuẩn là D-xylose và L-arabinose được mua từ hãng Megazyme.