CHƢƠNG II PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp
2.2.4. Tinh sạch xylanase
Đối với chủng tái tổ hợp:
Quy trình tinh sạch xylanase tái tổ hợp từ chủng A. niger tái tổ hợp được mô tả tóm tắt trong hình 2.3
Dịch enzym thô
Ly tâm 10000 vòng/phút,10 phút
Qua cột PronondTM
Enzym xylanase tinh sạch
Hình 2.3: Sơ đồ quy trình tinh sạch xylanase tái tổ hợp từ chủng A. niger
tái tổ hợp
Đối với chủng tự nhiên:
Dịch enzym thô
Ly tâm 10000 vòng/phút,10 phút
Qua cột sắc ký lọc gel (Sephadex G200)
Qua cột sắc ký trao đổi ion (DEAE-sephadex)
Enzym xylanase tinh sạch
Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tinh sạch xylanase từ chủng A. oryzae
tự nhiên
2.2.4.1. Tinh sạch xylanase tái tổ hợp bằng cột ProbondTM
Protein tái tổ hợp được tinh sạch sử dụng kit tinh sạch ProbondTM (Invitrogen). Cột tinh sạch 10ml theo kit được cho 2 ml resin vào, resin lắng xuống nhờ trọng lực và
hút nhẹ dịch nổi ra. Cột Ni2+ được rửa 2x với nước khử ion và đệm gắn cột (NBB) pH 8,0. Sau đó hút 9 ml protein (dịch nổi) cần tinh sạch đưa lên cột, đặt lên máy lắc rung nhẹ để các hạt resin luôn giữ ở trạng thái lơ lửng trong dịch protein 30-60 phút để xynalase gắn vào hạt resin. Tiếp theo, các hạt resin được để lắng và loại bỏ dịch trong cột. Cột được rửa 3x với đệm rửa (NWB) pH 8,0. Protein gắn cột được thôi ra bằng dung dịch (NEB) pH 8,0 với 11 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1 ml. Hàm lượng protein và số đơn vị hoạt tính enzyme được xác định trong mỗi phân đoạn.
2.2.4.2. Tinh sạch xylanase tự nhiên
Tinh sạch xylanase bằng cột sắc ký Sephadex G-200
Đầu tiên, xylanase được tinh sạch bằng sắc ký lọc gel.
Nguyên lý:
Sắc ký lọc gel sẽ tách các phân tử dựa trên sự khác nhau về kích thước và khối lượng các phân tử. Gel (các hạt hình cầu) nhồi vào cột tạo thành mạng lưới lỗ xốp. Khi hỗn hợp mẫu được nạp vào cột, các phân tử có kích thước nhỏ sẽ khuếch tán vào các lỗ. Còn các phân tử kích thước lớn sẽ khó vào lỗ hơn, tiếp tục đi dọc theo cột; do đó, sẽ được rửa giải ra khỏi cột sớm hơn những phân tử nhỏ [31].
Tiến hành:
Dịch enzym thô (dịch lên men) sau khi được ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi và đưa dịch nổi lên cột sắc kí lọc gel Sephadex G-200. Kích thước cột là 0,6 x 26 cm, được cân bằng với đệm kali phosphat 50 mM, pH 7,5. Tốc độ dòng chảy khoảng 25 ml/h. Thu thể tích mỗi phân đoạn 1,5 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzym được xác định trong mỗi phân đoạn.
Tinh sạch xylanase bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-Sephadex
Sau khi tinh sạch bằng sắc ký lọc gel, bước tiếp theo, xylanase được tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-Sephadex [25, 30].
Ở pH khác pI của protein, protein mang điện tích. Cho hỗn hợp protein chảy qua cột sắc ký chứa pha tĩnh (Diethylaminoethyl) là các hạt tích điện dương được gắn trong mạng lưới gel Sephadex. Các protein mang điện âm sẽ liên kết với pha tĩnh bằng lực ion mạnh hơn các protein mang điện dương. Hỗn hợp mẫu chất đang gắn vào pha tĩnh trong dung dịch đệm có nồng độ ion thấp. Pha động chạy qua cột có nồng độ ion lớn (nồng độ NaCl cao) sẽ cạnh tranh gắn pha tĩnh với protein, đẩy protein ra khỏi pha tĩnh, theo dòng chảy ra khỏi cột. Tùy thuộc vào điện tích mỗi protein mà lực ion mạnh yếu khác nhau, từ đó các protein sẽ được rửa giải ra khỏi cột ở những điểm khác nhau theo gradient nồng độ NaCl. Protein mang điện dương sẽ được rửa giải ra trước [25].
Tiến hành:
Các phân đoạn qua cột Sephadex G200 có hoạt tính xylanase cao nhất được đưa lên cột sắc kí trao đổi ion DEAE-Sephadex. Cột có kích thước 0,6 x 26 cm được cân bằng với đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 chứa 50 mM NaCl.Tốc độ dòng chảy khoảng 24 ml/h. Thu mẫu bằng đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 chứa NaCl với nồng độ NaCl tăng dần 0,2 M, 0,4 M, 0,6 M, 0,8 M và 1 M; sử dụng 10 ml đệm để thôi mẫu ứng với mỗi nồng độ. Thu thể tích mỗi phân đoạn 1,5 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzym được xác định trong mỗi phân đoạn.